|
研究背景衰老是自然生物界最基本的规律之一,其一直是科学家们感兴趣的研究课题,近十余年来人们对衰老过程进行了大量的基础性研究,皮肤衰老更是其中的热点。就皮肤而言,长期以来人们就知道,进入绝经期的妇女会出现皮肤干燥、易脱屑、易淤血损伤等现象；遭受损伤后又易引发静脉性的溃疡、压疮等慢性创面问题。采用雌激素治疗后可明显改善这些现象或阻止它们的发生。因此,皮肤作为“激素敏感性器官”的概念已为大家所接受。而雌激素与皮肤老化、创面愈合关系的研究也越来越受到重视。但总体上较为零散、缺乏深度。从而在某种程度上也制约了雌激素替代治疗(etrogen replacement therapy, ERT)的应用。但随着对雌激素作用机理的探明,选择性调节雌激素药物的出现,其在皮肤组织中的应用将有极大的前景。因此,探讨其机制已成为当前极为迫切的任务之一。皮肤衰老研究证实,胶原是人体细胞外基质的主要结构蛋白,胶原纤维约占真皮纤维的90%。研究表明,随着年龄增长,皮肤胶原纤维变细,真皮层变薄。一般婴儿及青年人皮肤Ⅰ型胶原含量约占70%,Ⅲ型胶原占30%。当皮肤老化时,两者比例逐渐倒置,胶原应力传导下降,抗剪切力减弱,胶原总含量减少,特别是可溶性胶原含量下降明显,同时真皮乳头层和网状层弹性纤维减少及退化,胶原纤维和弹性纤维排列也渐趋紊乱,引起皱纹、松弛及下垂。皮肤的老化可分为内源性老化和外源性老化两类。内源性老化指的是单纯随年龄增长而产生的皮肤改变,主要表现为上皮轻度变薄、弹性丧失和某些物质的丢失。外源性老化即环境因素引起的老化,主要指的是光化性老化(Photoaging),由于日光中紫外线(Ultraviolet,UV)辐射是环境因素中导致皮肤老化的主要因素,所以皮肤外源性老化又称为皮肤光老化。皮肤光老化可通过一定的手段预防及治疗,而内源性老化则不可避免且呈持续性进展。随着社会的发展,人们发现,影响组织衰老的因素极多,也极为复杂。虽然皮肤自身有较强的再生能力,但如何维持皮肤的弹性、延缓其老化仍是从古至今人类探求的重要课题。已有大量研究表明,雌激素对于延缓皮肤衰老具有显著的作用,其作用途径可能涉及多条细胞内信号转导通路,并且有进一步的研究发现,TGF-β1/Smads信号通路表达水平的上调,亦有助于改善皮肤的衰老状况。但由于雌激素在人体内生物学作用的多样性,使得目前有关雌激素及其受体延缓皮肤衰老的具体作用机制,特别是受体后信号转导途径的调控,尚不十分清楚,相关方面的研究在国内外至今仍罕见报道。本课题旨在通过对衰老皮肤雌激素受体表达及信号转导通路的研究,了解皮肤衰老网络调控机制,最终为临床上科学有效的延缓皮肤衰老,尽可能的避免全身毒副作用,提供理论基础和切实可行的治疗手段。雌激素是主要由卵巢分泌的类固醇激素,它的主要作用是促进女性生殖器官的发育和第二性征的出现并维持其正常状态,同时它影响全身主要器官系统的功能。皮肤是雌激素发挥作用的最大非生殖器官。雌激素对各种不同靶器官的生物学活性是由配体的结构、雌激受体(ER)亚型等状况来决定。皮肤组织为雌激素的靶组织,为雌激素替代治疗延缓皮肤老化提供了可能。雌激素在皮肤中发挥重要的作用,主要表现在：(1)阻止皮肤老化。绝经后女性皮肤发生深刻的变化：皮肤松弛和弹性下降、出现细小皱纹,同时皮肤干燥脱屑、修复功能减退、毛发数量减少等,组织学表现为：甘油聚糖浓度、水容量、胶原容量下降,这些变化可以通过局部和系统应用雌激素得到逆转。(2)对皮肤损伤的修复作用。有人研究认为慢性损伤不易成功修复的原因是白细胞过度增多,胶原沉积下降。研究认为：局部应用雌激素可明显逆转老年病人损伤修复变慢的状况。雌激素是一种损伤修复调节因子,在人类和动物模型中能逆转年龄相关的损伤愈合。(3)调节毛发生长：对女性AGA病人局部应用雌二醇苯甲酸醋、雌二醇戊酸醋取得明显的效果,它能使毛发生长期延长、休止期缩短。(4)抑制皮脂腺分泌。雌二醇是机体中主要发挥作用的激素,其生物学效能最强。而苯甲酸雌二醇(estradio1benzoate,EB)则是临床上进行雌激素替代治疗(ERT)的主要药物之一。成纤维细胞是真皮中的主要细胞成分之一,它形成真皮中的胶原纤维、弹性纤维、基质等。真皮中胶原水平的下降是导致绝经后妇女老化外观的主要原因之一。研究表明：应用雌二醇对鼠真皮成纤维细胞进行培养,发现胶原合成增加约76%。对大鼠模型的研究发现：在光损伤皮肤和正常皮肤组织中、局部雌激素是重要的结缔组织调节因子,它能刺激新的结缔组织带的形成。有人研究了年龄的老化和绝经两种因素对皮肤胶原的影响,结果表明,相对于年龄的老化,绝经对胶原的影响更为显著,表明了激素对胶原合成和表达有非常重要的意义。研究已证实了ER在人成纤维细胞中的分布。转化生长因子(TGF-β1)是伤口愈合中重要的调控因子,同时也被公认为最强的致纤维化因子,激活细胞内信号转导分子Smad3是其促进胶原合成的必由途径,因此推测：雌激素是否可以调控TGFβ1/Smad3信号通路以增加皮肤胶原蛋白的含量,而达到延缓皮肤老化的目的,并通过促进胶原蛋白合成及抑制胶原蛋白降解两条途径来实现。雌激素是否对皮肤组织中TGFβ1/Smad3信号通路有影响,目前国内外研究较少。本研究以去卵巢雌性大鼠为实验对象,通过检测苯甲酸雌二醇调节TGF β1及Smad3蛋白的表达,探讨雌激素延缓皮肤老化可能存在的相关机制。目的建立绝经期大鼠模型,观察苯甲酸雌二醇对去卵巢雌性大鼠皮肤组织的抗衰老作用,初步探讨延缓皮肤老化的网络调控机制。方法1.绝经期动物模型的制备：雌性成年Wistar大鼠35只,清洁级,体质量180±20g,由广东省南方医科大学动物实验中心提供。将此大鼠随机分为四组：A组：实验对照组,n=5；B组：假手术组,n=10；C组：去卵巢组,简称为手术组,n：10；D组：去卵巢苯甲酸雌二醇治疗组,简称为治疗组,n=10。适应性饲养一周后行腹部正中切口双侧卵巢摘除术。以10%水合氯醛(300mg/kg)行腹腔注射麻醉,其中,假手术组只摘取双侧卵巢周围少许脂肪组织,而手术组和治疗组均予以摘除双侧卵巢。手术切口均给予青霉素粉剂以预防感染。术后第四周开始,治疗组给予肌肉注射苯甲酸雌二醇(estradiol benzoate, EB),生产厂家为上海通用药业股份有限公司,0.2mg/kg,1次/3天；其余各组给予生理盐水肌注,0.05ml/只,连续给药四周。2.病理标本制备及免疫组化实验：四周后处死各组大鼠,脱毛后取大鼠背部正中皮肤约0.5cm×0.5cm,乙醚脱脂处理,经10%甲醛溶液固定,常规石蜡包埋、连续切片,行HE染色,并同时进行免疫组化实验(SP二步法)测定TG Fβ1及Smad3的表达情况。3.病理学观察：光镜200倍视野下观察各组大鼠皮肤组织的病理学变化。4.图像分析：使用BX-51正置荧光显微镜(Olympus公司),选择200倍视野,每张免疫组化片任选4个视野,拍照后用电脑数字软件(Image-pro plus. Version6.3.1.542)进行图像分析,测定平均光密度值,所测数据导入Excel,建立数据库。5.统计学处理：数据结果采用SPSS13.0软件进行分析,所有计量资料均以x±s表示。数据统计前均进行方差齐性检验,若方差齐,使用one-way ANO VA;而假手术组、手术组及治疗组分别与实验对照组两两比较时用Dunnett-t法(2-sided), P<0.05时差异有统计学意义。结果经Levene方差齐性检验,各组TGF β1、Smad3平均光密度值总体方差齐(P=0.100,P=0.688)。经one-way ANOVA分析得知,四组间TGF β1、Smad3平均光密度值均数不全相等,差异具有统计学意义(F=1127.262,F=1222.970,P<0.001)。与对照组相比,治疗组大鼠皮肤组织中的TGF β1及Smad3表达升高(P<0.001)；假手术组与对照组相比,其TGF β1及Smad3的表达无变化(P=0.808,P=0.694)；手术组与对照组相比,其TGF β1及Smad3的表达降低(P<0.001)。结论苯甲酸雌二醇能通过对TGF β1、Smad3分子表达的影响,直接调控大鼠皮肤中成纤维细胞的增殖,从而延缓皮肤老化。缓解皮肤衰老进程的网络机制相当复杂,有众多细胞因子的参与及多种因素的影响。然而,苯甲酸雌二醇在延缓皮肤老化的过程中对TGF β1/Smad3信号转导通路的调控可能是其中机制之一。
|