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DANCE与细胞代谢模式改变的关系

作　者: 伍小华
导　师: 刘誉
学　校: 暨南大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: DANCE DSGC K562 白细胞 基因表达谱
分类号: R329
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


目的：在细胞、mRNA、蛋白的水平上研究不同胞内密度细胞的代谢变化，进一步探讨细胞代谢模式改变与DANCE（Density Alteration in Non-physiological Cells）的关系。方法：1. K562细胞分为对照组和0.1%VA（维甲酸）实验组，37℃培养48h，进行非连续蔗糖密度梯度离心（Discontinuous Sucrose Gradient Centrifugation,DSGC），分离细胞各条带。2. Annexin V-PI双染法检测K562细胞中的S60、S50（正常组）、S50、S40（VA组）四条带细胞的凋亡情况。3.高通量测序检测S50、S40（VA组）细胞中基因组mRNA的表达水平。4.通过Real-time PCR、Western Blot检测不同条带K562细胞的mRNA和蛋白表达差异。5.应用淋巴细胞分离液分离并制备糖尿病人外周血白细胞，再经DSGC分离得到S60、S50两条带白细胞。6. PCR和Western Blot检测不同条带白细胞（糖尿病）的mRNA和蛋白表达差异。结果：1.对照组K562细胞经DSGC分离得到S60和S50两条带，0.1%VA处理的实验组则分离得到S50和S40两条带。2.对照组的S60和S50以及VA实验组的S50和S40四条带的细胞经流式分析发现，细胞坏死的比例依次增加，以实验组S40条带细胞的最高。3. VA实验组S50与S40两条带细胞的基因表达谱具有显著性差异。与S50相比，S40的细胞有62个基因的mRNA表达显著上调，另有19个基因的mRNA表达显著下调。4. Real-time PCR和Western Blot检测部分与细胞凋亡和DNA修复相关基因的mRNA和蛋白水平，我们发现VA实验组的S50与S40两条带细胞的mRNA及蛋白水平具有显著差异，该结果与高通量基因表达谱分析的结果一致。5. DSGC分离糖尿病人外周血白细胞得到的S60和S50两条带细胞经PCR和Western Blot分析，发现炎症相关因子CD36和IL-6两个基因的表达水平具有显著差异，CD36在S50白细胞中的水平显著高于S60细胞，但IL-6在S60白细胞中的水平则显著高于S50细胞。结论：K562细胞和糖尿病人外周血白细胞的DANCE反应伴随着细胞中基因表达谱的改变，提示细胞的DANCE反应与细胞的代谢改变密切相关。

全文目录


中文摘要  3-5
Abstract  5-7
目录  7-9
绪论  9-16
实验材料与方法  16-31
  1 细胞株  16
  2 试剂及耗材  16-17
  3 仪器  17-18
  4 试剂配制  18-21
  5 引物序列  21-22
  6 实验方法  22-31
    6.1 K562 细胞复苏与培养  22
    6.2 K562 细胞的 DSGC 分离  22-23
    6.3 Annexin V/PI 双染检测各条带 K562 细胞凋亡情况  23
    6.4 高通量测序检测 K562 细胞 S50、S40（VA 组）细胞中各基因的 mRNA 表达水平  23-24
    6.5 Real-time PCR 检测 S50、S40（VA 组）两类 K562 细胞样品中 AIMP2、APLF、WIPI1 的表达水平  24-26
    6.6 Western Blot 检测 S60、S50（正常组），S50、S40（VA 组）四类 K562 细胞样品中 AIMP2、APLF、WIPI1 的表达水平  26-27
    6.7 人外周血白细胞的分离  27-28
    6.8 人外周血白细胞的 DSGC 分离  28
    6.9 PCR 检测 S60、S50 两类白细胞样品中 CD36 和 IL-6 的表达水平  28-29
    6.10 Western Blot 检测 S60、S50 两类白细胞样品中 CD36 和 IL-6 表达水平  29-30
    6.11 统计学处理  30-31
实验结果与分析  31-43
  1 K562 细胞的 DSGC 分离  31-32
    1.1 K562 细胞 DSGC 分离结果  31
    1.2 K562 细胞 DSGC 分离结果分析  31-32
  2 K562 细胞 S50、S60（正常组），S40、S50（VA 组）条带细胞凋亡测定  32-33
    2.1 K562 细胞流式结果  32-33
    2.2 K562 细胞流式结果分析  33
  3 高通量测序检测 S40、S50（VA 组）细胞中各基因的 mRNA 表达水平  33-38
    3.1 K562 细胞高通量测序结果  33-35
    3.2 VA 处理的 K562 细胞 S40 和 S50 条带代谢差异分析  35-38
  4 Real-time PCR、Western Blot 检测 S50 与 S40（VA 组）部分基因与蛋白  38-40
    4.1 K562 细胞 Real-time PCR 检测结果  38
    4.2 K562 细胞 Real-time PCR 检测结果分析  38-39
    4.3 K562 细胞 Western Blot 检测结果  39
    4.4 K562 细胞 Western Blot 检测结果分析  39-40
  5 RT-PCR、Western Blot 检测不同条带白细胞的 mRNA 和蛋白表达差异  40-43
    5.1 人外周血白细胞 DSGC 分离结果  40-41
    5.2 人外周血白细胞 RT-PCR 检测结果  41
    5.3 人外周血白细胞 Western Blot 检测结果  41
    5.4 人外周血白细胞实验结果分析  41-43
讨论  43-46
全文结论  46-47
不足与展望  47-48
参考文献  48-51
英文缩略词（Abbreviation）  51-52
致谢  52

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体形态学 > 人体组织学
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