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苦参碱、积雪草苷对人肺成纤维细胞干预作用的实验研究

作　者: 钱星佳
导　师: 周玉皆
学　校: 南京中医药大学
专　业: 中医学
关键词: 苦参碱 积雪草苷 人肺成纤维细胞 慢性阻塞性肺病 气道重塑 细胞因子
分类号: R285.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


目的：本研究旨在利用中药苦参碱及积雪草营作用于人肺成纤维细胞,通过研究对炎症及非炎症刺激后成纤维细胞的增殖及基因表达的变化来评价苦参碱及积雪草苷对气道重塑的作用,并探讨其作用机制,为苦参碱及积雪草苷在COPD气道重塑的临床应用提供理论依据。方法：体外培养人肺成纤维细胞用于实验。不同浓度的苦参碱(0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4mmol/L)及积雪草苷(6.25、12.5、25、50、100、200、400ug/ml)作用于细胞,运用CCK-8法测定细胞增殖受抑制情况,绘制细胞生长曲线；Realtime PCR法检测血管紧张素Ⅱ10-7mol/L诱导的人肺成纤维细胞加入苦参碱0.8mmol/L及积雪草苷400ug/ml干预24小时后TGF-β1、CTGF及Ⅰ型胶原等mRNA的表达情况,以及2%02刺激24小时后人肺成纤维细胞加入苦参碱0.8mmol/L及积雪草苷400ug/ml干预后HIF-1α及VEGF mRNA的表达情况。结果：(1)苦参碱、积雪草苷对成纤维细胞增殖的影响(CCK-8方法)：培养液中加入不同浓度苦参碱孵育细胞24小时后检测OD值：正常对照组为0.81±0.06,浓度0.1mmol/L时为0.83±0.12,0.2mmol/L时0.76±0.13,0.4mmol/L时0.85±0.06,此三个浓度下的OD值与正常组相比均无显著意义(P>0.05)；浓度为0.8mmol/L时OD值0.21±0.08,1.6mmol/L时0.14±0.08,3.2mmol/L时0.13±0.07,6.4mmol/L时0.12±0.03,以上各浓度对细胞增殖的抑制作用明显,与对照组相比有统计学意义(P<0.01)；培养液中加入不同浓度积雪草苷孵育细胞24小时后检测OD值：正常对照组为0.82±0.07,浓度6.25ug/ml时为0.73±0.07,12.5ug/ml时0.74±0.12,25ug/ml时0.79±0.08,50ug/ml时0.82±0.11,100ug/ml时0.75±0.03,200ug/ml时0.79±0.05,200ug/ml以下的药物浓度对细胞增殖无明显抑制作用,与对照组相比无统计学意义(P>0.05)；浓度达到400ug/ml时,OD值为0.59±0.03,与对照组相比有统计学意义(P<0.05)。(2)成纤维细胞中TGF-β1、CTGF及Ⅰ型胶原等mRNA的表达情况：通过Realtime PCR方法测定,以正常对照组的TGF-β1、CTGF及Ⅰ型胶原的mRNA表达1.00±0.00为标准；1)血管紧张素Ⅱ的作用：加入血管紧张素Ⅱ10-7mol/L诱导24小时后,TGF-P, mRNA为206.37±129.83,与对照组相比有统计学意义(P<0.05)；CTGF为21.92±7.58,有显著差异(P<0.01)；Ⅰ型胶原为至368.64±192.78,有显著差异(P<0.01)；2)苦参碱的作用：在血管紧张素Ⅱ诱导的基础上,加入苦参碱0.8mmol/L共同孵育细胞24小时后,TGF-p, mRNA表达为1.86±0.10,与血管紧张素Ⅱ刺激组相比有统计学意义(P<0.05);CTGF为0.0014±0.00071,有显著差异(P<0.01)；Ⅰ型胶原为0.46±0.36,有显著差异(P<0.01)；3)积雪草苷的作用：在血管紧张素Ⅱ诱导的基础上,加入积雪草苷400ug/ml共同孵育细胞24小时后,TGF-β1mRNA表达为2.31±1.39,与血管紧张素Ⅱ刺激组相比有统计学意义(P<0.05);CTGF为0.0017±0.00163,有显著差异(P<0.01)；Ⅰ型胶原为0.51±0.32,有显著差异(P<0.01)。(3)成纤维细胞HIF-1α及VEGF mRNA的表达情况：通过Realtime PCR方法测定,以正常对照组的HIF-1α及VEGF mRNA的表达1.00±0.00为标准；1)低氧的作用：以2%O2诱导24小时后,HIF-1αmRNA表达为19.50±11.54,与对照组相比有统计学意义(P<0.01)；VEGF为157.46±112.30,有显著差异(P<0.01)；2)苦参碱的作用：在2%O2诱导的基础上,加入苦参碱0.8mmol/L作用24小时后,HIF-1αmRNA表达为0.78±0.74,与低氧刺激组相比有显著差异(P<0.01)；VEGF为5.53±5.89,有统计学意义(P<0.05)；3)积雪草苷的作用：在2%O2诱导的基础上,加入积雪草苷400ug/m作用24小时后,HIF-1αmRNA表达为0.14±0.08,与低氧刺激组相比有显著差异(P<0.01)；VEGF为3.56±3.42,有统计学意义(P<0.05)；结论：(1)正正常情况下人肺成纤维细胞中TGF-β1、 CTGF及Ⅰ型胶原HIF-1α及VEGF均有少量表达。(2)AngⅡ刺激人肺成纤维细胞后,细胞TGF-β1、CTGF及Ⅰ型胶原的mRNA表达增强,说明AngⅡ对TGF-β1、 CTGF及Ⅰ型胶原的表达有上调作用,是人肺成纤维细胞增殖过程中重要的诱导剂。(3)经低氧刺激后,人肺成纤维细胞HIF-1α及VEGF mRNA的表达上调,表明低氧对人肺成纤维细胞有刺激作用。(4)苦参碱一定浓度范围对人肺成纤维细胞的增殖有明显的抑制作用,目.对血管紧张素Ⅱ诱导的细胞TGF-β1、CTGF及Ⅰ型胶原mRNA的表达及低氧刺激后细胞HIF-1α及VEGF mRNA的表达有抑制作用,提示苦参碱可能对气道重塑的发生发展有抑制作用。(5)积雪草苷低剂量各浓度组对人肺成纤维细胞的增殖均无明显抑制作用,其原因可能是由于积雪草苷具有较低的细胞毒性；但积雪草苷对细胞TGF-β1、 CTGF及Ⅰ型胶原基因的表达以及低氧情况下细胞HIF-1α及VEGF的表达有明显的抑制作用,说明其能够抑制成纤维细胞增生、活化过程中各种炎性因子的表达,从而可能对延缓气道重塑的发生发展有一定的作用。本结果提示：从细胞层面来看,苦参碱一定浓度范围可以抑制人肺成纤维细胞的增殖,苦参碱及积雪草苷均可以抑制其TGF-β1、CTGF、Ⅰ型胶原及HIF-1α、VEGF等基因的表达,可能对COPD气道重塑发生发展过程有重要影响。

全文目录


目录  5-7
中文摘要  7-10
Abstract  10-13
缩略词表  13-14
前言  14-15
第一部分 COPD气道重塑研究概述  15-25
  1. 西医对COPD的研究  15-21
    1.1 COPD相关发病机制的概述  15-17
    1.2 气道重塑在COPD发展过程中的作用  17-21
    1.3 成纤维细胞对气道重塑的影响  21
  2. 中医对COPD气道重塑的研究进展  21-23
    2.1 病因病机  22
    2.2 病理特征  22
    2.3 治则治法  22-23
  3. 中药苦参碱及积雪草苷在临床的应用  23-25
    3.1 苦参碱的现代研究  23
    3.2 积雪草苷的现代研究  23-25
第二部分 实验研究  25-33
  1. 实验材料  25-26
    1.1 细胞  25
    1.2 试剂  25
    1.3 主要仪器设备  25-26
  2. 实验方法  26-28
    2.1 细胞培养  26-27
    2.2 细胞毒性实验  27
    2.3 Realtime PCR法检测药物干预后HFL-1细胞中各基因的表达  27-28
  3. 统计学处理  28-33
    3.1 细胞毒性实验  29-30
    3.2 Realtime PCR检测ANGⅡ刺激后中药干预HFL-1细胞各基因的表达情况  30-31
    3.3 Realtime PCR检测低氧刺激后中药干预HFL-1细胞各基因的表达情况  31-33
第三部分 讨论  33-37
  1. 成纤维细胞在气道重塑过程中的作用  33-34
  2. 血管紧张素Ⅱ对成纤维细胞及气道重塑的作用  34-35
  3. 低氧对成纤维细胞的作用及其机制  35-36
  4. 苦参碱、积雪草苷对成纤维细胞的作用及机理探讨  36-37
    4.1 苦参碱对成纤维细胞的作用及机理探讨  36
    4.2 积雪草苷对成纤维细胞的作用及机理探讨  36-37
结论  37-39
参考文献  39-45
攻读硕士学位期间取得的学术成果  45-46
致谢  46

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