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银杏内酯B抑制血小板CD40Ligand表达的分子机制研究

作　者: 闫琰
导　师: 李兴广
学　校: 北京中医药大学
专　业: 临床中药学
关键词: CD40L 胶原 凝血酶 PI3K/Akt 血小板 银杏内酯B
分类号: R285.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


目的：探讨银杏内酯B(Ginkgolide B)对活化血小板CD40Ligand(CD40L)的影响以及相关的分子机制。材料与方法：首先取正常人血,1100rpm离心15min,分离富血小板血浆,加入TYRODE/HEPES Buffer, ACD(1:9),2mmol·L-1EDTA,再次离心,弃上清,悬浮细胞,重复两次,以去除血浆蛋白和其他血细胞,获得血小板悬浮液。接下来用比浊法测定血小板聚集率,用Chrono-Log血小板聚集分析仪测定血小板聚集。将血小板悬浮液分别用0.2g·L-1,0.4g·L-1和0.6g·L-1银杏内酯B孵育细胞5min,然后用10g·L-1胶原(collagen)、1U·ml-1凝血酶(thrombin)刺激血小板10min,分析血小板聚集率。将血小板活化后的悬浮液加入SDS终止反应,应用Western Blot方法检测蛋白。将样本电泳,转膜,用5%牛血清白蛋白封闭,室温2小时,洗膜3次。分别加入特异性抗体(PI3K、β-Actin、 Akt、P-Akt、CD40L、GAPDH、P-p38、p38、G10、Syk),4℃孵育过夜。洗膜3次后,加入二抗,室温孵育1小时,洗膜5次。使用ECL化学发光,用凝胶成像仪成像。结果：1.银杏内酯B对血小板聚集的影响确认了10mg·L-1胶原诱导血小板发生较强的聚集,分别用0.2g·L-1,0.4g·L-1和0.6g·L-1银杏内酯B预处理细胞后,血小板聚集率明显降低,聚集率分别为77.07±13.82%、60.65±18.08%和48.39±14.28%。与单纯胶原刺激组比较,差异具有统计学意义,n=6,P<0.05。确认了1U·m1-1凝血酶诱导血小板发生较强的聚集,分别用0.2g·L-1,0.4g·L-和0.6g·L-1银杏内酯B预处理细胞后,血小板聚集率明显降低,聚集率分别为88.20±7.75%,72.28±6.36%和57.82±6.15%。与单纯凝血酶刺激组比较,差异具有统计学意义,n=4,P<0.05。2.银杏内酯B对CD40L释放的影响Western Blot结果显示,以胶原刺激血小板时,静态血小板CD40L释放为100.47±31.10,胶原刺激血小板活化后CD40L释放明显增加至130.7±24.14,分别用0.2g·L-0.4g·L-1和0.6g·L-1银杏内酯B预处理细胞后,CD40L的释放以剂量依赖性方式被抑制,释放分别为117.73±18.83,104.94±26.38,82.16±25.03。与单纯胶原刺激组比较,差异均有统计学意义,n=6,P<0.05。Western Blot结果显示,以凝血酶刺激血小板时,静态血小板CD40L释放为103.12±38.12,凝血酶刺激血小板活化后CD40L释放明显增加至142.0l±39.23,分别用0.2g·L,0.4g·L-1和0.6g·L-1银杏内酯B预处理细胞后,CD40L释放以剂量依赖性方式被抑制,表达分别为123.70±35.42,108.71±38.12,87.65±32.00。与单纯凝血酶刺激组比较,差异均有统计学意义,n=8,P<0.05。3.银杏内酯B对PI3K表达的影响Western Blot结果显示,以胶原刺激血小板时,静态血小板PI3K表达为112.37±28.22,胶原刺激血小板活化后PI3K表达轻微增加至115.72±26.04,分别用0.2g·L-1,0.4g·L-1和0.6g·L-1银杏内酯B预处理细胞后,PI3K表达无明显变化,表达分别为114.83±22.34,115.08±24.27,114.16±27.03。与单纯胶原刺激组比较,差异没有统计学意义,n=9,P>0.05。Western Blot结果显示,以凝血酶刺激血小板时,静态血小板PI3K表达为111.78±18.22,凝血酶刺激血小板活化后PI3K表达轻微增加至114.72±20.04,分别用0.2g·L-1,0.4g·L-1和0.6g·L-1银杏内酯B预处理细胞后,PI3K表达无明显变化,表达分别为110.64±22.34,115.08±20.74,111.46±19.33。与单纯凝血酶刺激组比较,差异没有统计学意义,n=10,P>0.05。4.银杏内酯B对Akt磷酸化的影响Western Blot结果显示,以胶原刺激血小板时,静态血小板P-Akt表达为41.30±19.38,胶原刺激血小板活化后P-Akt表达明显增加至88.14±7.85,分别用0.2g·L,0.4g·L-1和0.6g·L-1银杏内酯B预处理细胞后,P-Akt表达以剂量依赖性方式被抑制,表达分别为79.84±30.53,39.67±15.73,14.11±7.08。与单纯胶原刺激组比较,0.4g·L-1和0.6g·L-1银杏内酯B处理组差异有统计学意义,n=3,P<0.05。Western Blot结果显示,以凝血酶刺激血小板时,静态血小板P-Akt表达为37.21±12.93,凝血酶刺激血小板活化后P-Akt表达明显增加至84.77±10.43,分别用0.2g·L-10.4g·-1和0.6g·L-1银杏内酯B预处理细胞后,P-Akt表达以剂量依赖性方式被抑制,表达分别为77.21±11.03,58.14±7.83,38.59±9.69。与单纯凝血酶刺激组比较,0.4g·L-和0.6g·L-1银杏内酯B处理组差异有统计学意义,n=4,P<0.05。5.银杏内酯B对p38磷酸化的影响Western Blot结果显示,以胶原刺激血小板时,静态血小板P-p38表达为51.43±11.74,胶原刺激血小板活化后P-p38表达明显增加至90.24±8.05,分别用0.2g·L-0.4g·-1和0.6g·L-1银杏内酯B预处理细胞后,P-p38表达以剂量依赖性方式被抑制,表达分别为77.36±19.51,68.92±12.63,51.22±7.85。与单纯胶原刺激组比较,0.4g·L和0.6g·L-1银杏内酯B处理组差异有统计学意义,n=6,P<0.05。Western Blot结果显示,以凝血酶刺激血小板时,静态血小板P-p38表达为32.18±11.92,凝血酶刺激血小板活化后P-p38表达明显增加至89.68±10.23,分别用0.2g·L-10.4g·L-1和0.6g·L-1银杏内酯B预处理细胞后,P-p38表达以剂量依赖性方式被抑制,表达分别为76.19±18.34,75.82±12.97,39.75±9.81。与单纯凝血酶刺激组比较,0.6g·L-1银杏内酯B处理组差异有统计学意义,n=5,P<0.05。6.银杏内酯B对Syk酪氨酸磷酸化的影响Western Blot结果显示,以胶原刺激血小板时,静态血小板4G10表达为38.55±10.48,胶原刺激血小板活化后4610表达明显增加至88.47±8.24,分别用0.2g·L-1,0.4g·L-1和0.6g·L-1银杏内酯B预处理细胞后,4G10表达以剂量依赖性方式被抑制,表达分别为74.32±13.35,60.91±14.04,48.81±6.76。与单纯胶原刺激组比较,差异均有统计学意义,n=6,P<0.05。Western Blot结果显示,以凝血酶刺激血小板时,静态血小板4G10表达为50.95±11.98,凝血酶刺激血小板活化后4G10表达明显增加至85.45±8.76,分别用0.2g·L-1,0.4g·L-1和0.6g·L-1银杏内酯B预处理细胞后,4G10表达以剂量依赖性方式被抑制,表达分别为77.24±14.68,70.42±15.12,53.49±8.19。与单纯凝血酶刺激组比较,差异均有统计学意义,n=6,P<0.05。结论：1.银杏内酯B能够有效抑制胶原、凝血酶诱导的血小板聚集。2.银杏内酯B能够有效抑制CD40L的表达。3.银杏内酯B明显抑制了Akt磷酸化。4.银杏内酯B能够有效抑制了p38磷酸化。5.银杏内酯B能够有效抑制了Syk络氨酸磷酸化。本研究结果表明,银杏内酯B能有效抑制胶原、凝血酶诱导的血小板聚集,并能通过抑制PI3K/Akt、p38MAPK、Syk通路的活化从而减少血小板释放CD40L,能够有效地减轻AS的炎症反应,对AS的发生和发展有明显的抑制作用。抗血小板药物的干预治疗,对动脉粥样硬化的防治研究提供了新的研究思路以及科学依据。

全文目录


目录  3-6
中文摘要  6-9
Abstract  9-14
文献综述一  14-24
  1 银杏叶的历代文献记载  14-15
  2 化学成分  15-16
    2.1 黄酮苷类化合物  15
    2.2 萜内酯类化合物  15-16
    2.3 其它  16
  3 药理作用  16-20
    3.1 对中枢神经系统的作用  16-18
    3.2 对心血管系统的作用  18-19
    3.3 其他  19-20
  4 临床应用  20-22
    4.1 高血压  20
    4.2 高脂血症  20-21
    4.3 脑梗死  21
    4.4 冠心病  21-22
    4.5 急性脑血栓  22
  5 结语  22-24
文献综述二  24-52
  1 CD40/CD40L系统  24-34
    1.1 CD40/CD40L的生物学特性  25-26
    1.2 CD40/CD40L系统在AS病变及相关细胞中的表达  26-29
    1.3 CD40/CD40L系统对AS的形成与发展的影响  29-31
    1.4 CD40/CD40L系统与AS斑块破裂的关系  31-32
    1.5 CD40/CD40L系统与相关信号通路的关系  32-33
    1.6 总结  33-34
  2 PI3K/Akt信号通路  34-39
    2.1 PI3K概念  34-35
    2.2 Akt概念  35-36
    2.3 PI3K/Akt信号通路的激活  36
    2.4 PI3K/Akt信号通路的调节  36-37
    2.5 PI3K/Akt信号通路与AS的关系  37
    2.6 PI3K/Akt信号通路与PDGF的关系  37-38
    2.7 PI3K/Akt信号通路与胶原的关系  38
    2.8 PI3K/Akt信号通路与MMP的关系  38
    2.9 PI3K/Akt信号通路与其他信号通路的关系  38-39
    2.10 总结  39
  3 p38MPAK信号通路  39-45
    3.1 p38MAPK的概念  39-40
    3.2 MAPK信号通路分类  40
    3.3 p38MAPK信号通路的激活  40-41
    3.4 p38MAPK信号通路的作用  41-42
    3.5 p38MAPK信号通路与AS炎症的关系  42-44
    3.6 总结  44-45
  4 Syk信号通路  45-49
    4.1 Syk的概念  45
    4.2 Syk的构成  45-46
    4.3 Syk的作用  46-47
    4.4 Syk与其他信号通路  47-48
    4.5 Syk与CD40L  48-49
    4.6 总结  49
  5 结语  49-52
前言  52-54
材料与方法  54-58
  1 实验材料  54-55
    1.1 实验仪器  54
    1.2 实验试剂  54-55
  2 实验方法  55-58
    2.1 血样处理  55
    2.2 比浊法测定血小板聚集率  55
    2.3 Werstern Blot方法检测蛋白水平  55-56
    2.4 统计学方法  56-58
结果  58-66
  1 银杏内酯B对血小板聚集的影响  58-59
    1.1 胶原刺激血小板活化  58
    1.2 凝血酶刺激血小板活化  58-59
  2 银杏内酯B对CD40L释放的影响  59-60
    2.1 胶原刺激血小板活化  59
    2.2 凝血酶刺激血小板活化  59-60
  3 银杏内酯B对PI3K表达的影响  60-61
    3.1 胶原刺激血小板活化  60-61
    3.2 凝血酶刺激血小板活化  61
  4 银杏内酯B对Akt磷酸化的影响  61-63
    4.1 胶原刺激血小板活化  61-62
    4.2 凝血酶刺激血小板活化  62-63
  5 银杏内酯B对p38磷酸化的影响  63-64
    5.1 胶原刺激血小板活化  63
    5.2 凝血酶刺激血小板活化  63-64
  6 银杏内酯B对Syk酪氨酸磷酸化的影响  64-66
    6.1 胶原刺激血小板活化  64-65
    6.2 凝血酶刺激血小板活化  65-66
讨论  66-70
参考文献  70-88
致谢  88-90
个人简历  90-92

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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药药理学 > 中药实验药理
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