学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

石参有效成分对胰岛细胞及肝细胞氧化应激损伤的保护作用

作　者: 吴伟斌
导　师: 庞建新
学　校: 南方医科大学
专　业: 药理学
关键词: 石参总黄酮软脂酸氧化应激染料木素水飞蓟宾白桦脂醇
分类号: R285.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 1次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

研究背景和目的据世界卫生组织调查显示,我国糖尿病(DM)已跃居继美国后的世界第二位患病大国,成年人群中糖尿病患病率达到3.5%左右,总人数超过4000万人；并且以每年0.1%的速度增长,而其中90%为Ⅱ型糖尿病(T2DM)。面对我国Ⅱ型糖尿病流行的严峻现状,中国糖尿病防治指南多次明确提出,目前我国Ⅱ型糖尿病防治面临的主要挑战和任务之一,就是降低Ⅱ型糖尿病的发病率,对Ⅱ型糖尿病进行早期干预。Ⅱ型糖尿病早期共同的特点是糖耐量减低(mpaired glucose tolerance, IGT)和/或空腹血糖受损Impaired fasting glucose, IFG)。IGT/IFG是介于正常血糖与糖尿病之间的一种糖代谢异常,是Ⅱ型糖尿病自然病程中一个阶段。正常空腹血糖为3.9-5.6mmol/L,糖尿病时空腹血糖≥7mmol/L。IGT表现为口服葡萄糖糖耐量试验(OGTT)时,其空腹血浆葡萄糖<7.0mmol/L,口服葡萄糖后2h血糖7.8-11.1mmol/L,而空腹血糖在5.6-7.0mmol/L之间时诊断为IFG。胰岛素抵抗(IR)和胰岛素分泌缺陷是IGT/IFG的主要原因。其中,IGT主要与胰岛素分泌缺陷有关,而IFG主要与IR有关。许多研究证明,IR和胰岛素分泌缺陷与血脂(尤其是游离脂肪酸,FFA)升高有关。目前IGT/IFG防治主要提倡饮食和生活方式干预。近年来,也有报道用小剂量二甲双胍、匹格列酮或阿卡波糖等进行IGT/IFG干预治疗,能明显预防糖尿病和心血管并发症。但由于不良反应多,再加上相当一部分IGT/IFG患者不会发展为Ⅱ型糖尿病,因此,口服降糖药早期干预还需要进行风险评估。而中医认为IGT/IFG类似于脾瘅,脾瘅的后果是转为消渴。中医对IGT/IFG治疗最主要的方法还是以辨证辨病结合治疗为主,辨证分型尚处于初期探索性阶段,缺乏规范的临床试验。IGT/IFG是发扬中医药治疗优势的潜在病种,它是糖尿病发病前期的“亚健康状态”,符合中医治未病的思想,适合长期治疗。故挖掘和应用中药、天然药物治疗IGT/IFG前景广阔,具有很好的实用价值。石参(Uraria crinita)是豆科狸尾豆属的多年生直立亚灌木植物,主要分布于我国南方沿海省份,包括广东、广西、海南、福建、台湾。《广西中药志》中记载：其味甘,性温,无毒；归肺、胃二经；行气痛,逐瘀化痰,治心胃气痛,有清热解毒、渗湿的功效。民间用于治疗胃炎、浮肿、风寒感冒等,我国南方常用作汤剂或炖剂,常食有保健作用,是效果良好的药材和药膳材料,享有“北有人参,南有石参”的美誉。为了进一步探讨石参的有效部位,我们对石参进行乙酸乙酯、乙醇和水梯度提取,观察了提取物对高脂饲料+小剂量链脲霉素诱导的C57BL/6J糖尿病小鼠的作用,结果表明,18g药材/kg的石参乙酸乙酯、乙醇和水梯度提取物,对模型小鼠非空腹血糖降糖效果依然不明显,但显著降低空腹血糖,分别降低25%、33%和27.3%,而对照组消渴丸1500mg/kg降低空腹血糖的水平为12%。3种提取物对血浆胰岛素水平无明显影响,但有不同程度降低游离脂肪酸(FFA)和甘油三酯(TG)的作用,尤其是乙醇提取物降低游离脂肪酸(FFA)的作用达54%,对照组消渴丸为33%。表明石参提取物中,有多种成分参与了改善IGT/IFG作用,该作用与降低血脂,尤其是降低游离脂肪酸(FFA)的有关。其中,最明显的为乙醇提取物。2009年,华中科技大学同济药学院和湖北省天然药物化学与资源评价重点实验室对石参化学成分进行了分离鉴定,从10kg石参根粗粉乙醇提取物中分离并鉴定了14个化合物,总含量为143mg。其中,已报道有明显降糖作用、可用于糖尿病治疗的化合物包括染料木素(14mg)、水飞蓟宾(8mg)和白桦脂醇(11mg),这3种化合物含量占总提取物含量的23.1%。我们认为,石参乙醇提取物效果更好的原因可能与这些成分有关。已知的石参提取物中,黄酮类化合物几乎占40%。众所周知,黄酮类有较强的抗氧化作用,为了评价石参中黄酮类的抗氧化活性,我们提取了石参总黄酮,研究其体外抗氧化活性及对大鼠胰岛瘤细胞(INS-1E)氧化应激的保护作用。结果发现,石参总黄酮体外对DPPH.ABTS.·OH自由基、H2O2、NO等自由基和脂质过氧化有明显抑制作用,并具有浓度依赖性。能显著提高氧化应激下的INS-1E细胞的存活率,提高谷胱甘肽(GSH)的含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性,降低丙二醛(MDA)和一氧化氮(NO)的含量。说明石参总黄酮具有清除自由基活性,对胰岛β-细胞氧化应激有保护作用。以上分析说明,石参提取物中,染料木素、水飞蓟宾和白桦脂醇这几种重要成分对IGT/IFG的改善作用可能通过4种途径,即降血脂、增加葡萄糖利用、抗氧化和促进胰岛素释放。而且,这几种成分通过多靶点作用,可能起到了协同效应。因为单一成分有效剂量都在每公斤体重(鼠)几十到几百毫克级,而我们给石参的量,按5-20mg/10kg药材的提取率算,大约是每公斤体重(鼠)几十微克,即使实际含量增加10倍,石参提取物中各成分的含量与文献报道的单一有效量也相差10-100倍以上,但改善IGT/IFG和降低脂肪酸效果相似,说明石参提取物中多种成分之间起了协同作用。基于以上假设,本课题将在前期工作基础上,用不同的细胞,研究石参总黄酮及有效成分染料木素,水飞蓟宾和白桦脂醇联合用药逆转体外细胞糖尿病模型的效果,为石参及其有效部位和有效成分用于Ⅱ型糖尿病早期预防提供安全、有效的措施和依据,对发掘应用中药预防Ⅱ型糖尿病,降低本病发病率有重要的意义。方法1.RN-m细胞氧化应激损伤及石参总黄酮的保护作用指数生长期的RIN-m细胞接种于96孔板中,每孔1*104个细胞,用0.01、0.05.0.1.0.2.0.3mg/ml等浓度的石参总黄酮处理细胞后,再用浓度为10mM的SNP构建损伤模型,然后用MTT法在570m处检测细胞活力。2.石参总黄酮对RIN-m细胞氧化应激状态下SOD活性,MDA, GSH和细胞内外液NO含量的影响指数生长期的RIN-m细胞接种于24孔板中,每孔1*105个细胞,用0.01、0.05.0.1.0.2.0.3mg/ml等浓度的石参总黄酮处理细胞后,再用浓度为10mM的SNP构建损伤模型,然后收集细胞上清液和细胞破碎液,用相应试剂盒检钡JMDA,GSH, NO含量和SOD活性。3.HEPG2细胞胰岛素抵抗及染料木素、水飞蓟宾和白桦脂醇联用对模型的逆转效果指数生长期的HEPG2细胞接种于96孔板中,每孔1*104个细胞,用总浓度为1、0.5、0.25nM的染料木素,水飞蓟宾和白桦脂醇的复方药物和0.25mM的软脂酸一起处理细胞12h,然后用含有1*10-7M胰岛素的基础培养基继续培养8h,然后用葡萄糖检测试剂盒检测上清中葡萄糖含量,再在570nm波长处检测细胞活力。4.INS-1E细胞脂肪酸损伤模型构建及染料木素、水飞蓟宾和白桦脂醇联用对模型的逆转效果指数生长期的INS-1E细胞接种于96孔板中,每孔1*104个细胞,用总浓度为2、1nM的染料木素,水飞蓟宾和白桦脂醇的复方药物和0.5mM的软脂酸一起处理细胞24h,然后用MTT法在570nm波长处检测细胞活力。结果1.石参总黄酮对RIN-m细胞氧化应激保护实验研究显示,10mM的SNP作用4小时后能显著的损伤细胞(P<0.05),而不同浓度的石参总黄酮皆能显著的提高模型的细胞活力(P<0.05)。2.石参总黄酮能在一定浓度下对RIN-m细胞氧化应激状态下MDA, GSH的含量和SOD活性产生改善作用,但只有在高剂量下才能对细胞内外液NO含量产生显著影响。石参总黄酮对RIN-m细胞的氧化应激具有一定的保护作用,其主要原因可能是由于其对GSH含量的影响和对SOD活力的改善。3.染料木素,水飞蓟宾和白桦脂醇的联合给药能在比单体给药较低的浓度就能显著的改善软脂酸诱导的HEPG2细胞胰岛素抵抗(P<0.05),提高在胰岛素存在下细胞对葡萄糖的利用,且这种提高并不通过提高细胞活力而达到,因此推断是药物改善了细胞胰岛素的敏感性而致。4.染料木素,水飞蓟宾和白桦脂醇的联合给药能显著的改善软脂酸诱导的INS-1E损伤,但复方给药和单体给药之间并无显著性差异。结论石参总黄酮对胰岛细胞的氧化应激损伤具有明显的保护效果,能有效的改善氧化应激状态下,细胞MDA, GSH含量和SOD活性。而石参总黄酮中主要的染料木素,水飞蓟宾和白桦脂醇联用能在不影响细胞活力的状态下,有效的改善肝细胞胰岛素抵抗程度,且联用能有效减低药物的剂量。且染料木素,水飞蓟宾和白桦脂醇联用能有效的保护脂肪酸损伤的胰岛细胞,但联用剂量并不能比单用显示出更优越的效果。本研究的创新之处1.在本实验室对石参研究成果的基础上,首次提出石参总黄酮中抗糖尿病作用的主要化学单体,且构建了不同的细胞模型对其进行实验以验证。

全文目录

摘要  3-8
ABSTRACT  8-17
前言  17-20
第一部分石参总黄酮对RIN-m细胞SNP损伤模型的保护作用  20-38
  一、实验材料与方法  20-30
  二、实验结果  30-37
  三、小结  37-38
第二部分染料木素、水飞蓟宾、白桦脂醇等三种单体化合物对软脂酸诱导的肝癌细胞胰岛素抵抗模型的逆转作用  38-50
  一、实验材料与方法  38-44
  二、实验结果  44-48
  三、小结  48-50
第三部分染料木素、水飞蓟宾、白桦脂醇等三种单体化合物对软脂酸诱导的胰岛瘤细胞高脂损伤模型的保护作用  50-59
  一、实验材料与方法  50-55
  二、实验结果  55-57
  三、小结  57-59
讨论  59-64
结论  64-65
参考文献  65-74
中英文缩写对照表  74-75
硕士期间发表的论文  75-76
致谢  76-77

石参有效成分对胰岛细胞及肝细胞氧化应激损伤的保护作用

内容摘要

全文目录

相似论文