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油樟叶提取物的体外抗肝癌活性及其作用机理研究

作　者: 叶奎川
导　师: 殷中琼; 周黎军
学　校: 四川农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 油樟 油樟叶提取物 BEL-7402 抗肝癌活性 作用机理
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


油樟[Cinnamomum longepaniculatum (Gamble) N. Chao]是樟科(Lauraceae)樟属(Cinnamomum)植物,是中国特有树种,为国家Ⅱ级重点保护野生植物,主要产在四川宜宾,在湖北、湖南、陕西、云南、江西、广西、广东等地均有分布。油樟叶含有丰富的芳香油(3.8～4.5%),是香料、医药、日用及化工产品的重要原料来源。为了充分利用油樟资源,本研究探讨了油樟叶各提取物对人肝癌BEL-7402细胞的体外抗肝癌细胞活性,并对筛选出的油樟叶抗肝癌活性有效部位进行抗肝癌机理研究。主要研究结果如下：1油樟叶各提取物的制备：采用系统溶剂法制备油樟叶提取物,即先将油樟叶用水蒸气蒸馏提取挥发油,再将提取挥发油后的油樟叶残渣用95%乙醇连续回流提取,最后用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇逐级萃取。通过以上提取工艺后,依次得到油樟叶挥发油、油樟叶乙醇提取物、油樟叶乙醇提取物石油醚萃取相、乙酸乙酯萃取相和正丁醇萃取相。油樟叶挥发油再通过气相色谱法分离得到五种单体物质：1,8-桉叶油素、黄樟油素、γ-松油醇、a-松油烯和松油烯-4-醇。2油樟叶各提取物对人肝癌BEL-7402细胞的体外抗肝癌活性：本研究采用体外培养细胞四甲基偶氮唑盐(3-4,5-diemethylthiarol-2,5-diphenytetrazolium bromide,MTT)快速比色法观察了油樟叶各提取物对人肝癌BEL-7402细胞的生长抑制情况。结果表明：油樟叶乙醇提取物、石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、油樟叶挥发油及其主要组成成分1,8-桉叶油素、黄樟油素、γ-松油醇、a-松油烯和松油烯-4-醇对人肝癌细胞的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration, IC50)分别为：>1280μg/mL、>1280μg/mL、723.5μg/mL、>1280μg/mL、1027.4μg/mL、>1280μg/mL、305.3μg/mL、312.14μg/mL、>1280μg/mL和>1280μg/mL。同时采用软琼脂细胞集落形成实验观察了油樟叶各提取物对人肝癌BEL-7402细胞体外集落形成的抑制情况。结果表明：油樟叶乙醇提取物、石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、油樟叶挥发油及其主要组成成分1,8-桉叶油素、黄樟油素、γ-松油醇、α-松油烯和松油烯-4-醇对人肝癌细胞体外集落形成率的ICso值分别为：>1280μg/mL、>1280μg/mL1123.4g/mL、>1280μg/mL、1047.6μg/mL、823.4μg/mL、313.7μg/mL、405.3μg/mL773.6μg/mL、和964.5μg/mL。以上研究结果表明:油樟叶各提取物中,黄樟油素和γ-松油醇具有较强的抗人肝癌BEL-7402细胞作用；其次为油樟叶挥发油和乙酸乙酯萃取物；油樟叶乙醇提取物、石油醚萃取物、1,8-桉叶油素、a-松油烯和松油烯-4-醇的体外抗肝癌BEL-7402细胞的作用较差；正丁醇萃取物对人肝癌BEL-7402细胞几乎无抑制作用。3黄樟油素体外抗人肝癌BEL-7402细胞的作用机理研究：光镜和电镜下观察了黄樟油素对人肝癌BEL-7402细胞的形态学影响、流式细胞仪观察了黄樟油素对肝癌细胞的细胞周期和凋亡率的影响、凝胶电泳观察了黄樟油素对肝癌细胞DNA完整性的影响。结果显示：黄樟油素作用之后,人肝癌BEL-7402细胞出现典型细胞凋亡形态学变化。细胞体积缩小,细胞核固缩、凝集；随着黄樟油素作用时间延长,固缩的细胞核逐渐碎裂为细小的团块。通过透射电镜观察到,黄樟油素作用之后,细胞核电子密度降低,核仁出现空泡状结构,同时还会导致细胞内线粒体脊断裂,呈现空泡状。随着作用时间延长,细胞核碎裂,伴随着凋亡小体出现。流式细胞仪分析发现,黄樟油素能将处于分裂期的人肝癌BEL-7402细胞阻滞在在Go/G1期和S期,而进入G2期的细胞数量减少,通过这个途径阻断了细胞的正常分裂增殖。同时,黄樟油素能够诱导BEL-7402细胞发生凋亡。实验发现,黄樟油素作用后的细胞与对照组相比,凋亡率显著增大,且随作用时间的延长,细胞胞凋亡率逐渐增大。黄樟油素作用后,人肝癌BEL-7402细胞DNA发生裂解,在凝胶电泳上表现为条带拖尾,并有典型的阶梯状条带出现。以上研究结果表明：黄樟油素能够从多方面改变人肝癌细胞的正常生理活动,从而起到抗肝癌作用。4γ-松油醇体外抗人肝癌BEL-7402细胞的作用机理研究：光镜和电镜下观察γ-松油醇对人肝癌细胞的形态学的影响、流式细胞仪观察了γ-松油醇对肝癌细胞的细胞周期和凋亡率的影响、凝胶电泳观察了γ-松油醇对细胞DNA完整性的影响。结果显示：光镜下：γ-松油醇作用后,人肝癌BEL-7402细胞变圆、体积缩小,细胞核固缩,细胞核深染,呈现典型的凋亡细胞形态变化；随作用时间延长,细胞结构变化越显著,原本凝结成团的细胞出现核碎裂,细胞内甚至出现空泡状结构。电子显微镜下可观察到细胞双层核膜消失,核内出现异染色质,最后细胞核碎裂,有凋亡小体出现。同时,随着细胞膜的破裂,部分细胞内的细胞器溢出并伴随结构的变化,最显著的是线粒体的脊断裂,后期几乎形成空泡状。γ-松油醇对人肝癌BEL-7402细胞周期的影响表现为：Y-松油醇作用之后,将处在分裂期的人肝癌BEL-7402细胞阻滞在Go/G1期和S期,导致进入G2期的细胞数量减少,阻断细胞正常的分裂增殖。同时,γ-松油醇诱导BEL-7403细胞发生凋亡,且随着作用时间延长,凋亡率逐渐增大。凝胶电泳结果显示：γ-松油醇引起人肝癌BEL-7402细胞DNA的裂解呈时间依赖性。γ-松油醇作用的前24h,细胞DNA几乎没有出现裂解现象；随着作用时间延长,细胞DNA呈现明显的裂解,在凝胶上出现显著的拖尾现象,有不同的条带出现。以上研究结果表明：γ-松油醇能够从多方面改变人肝癌细胞的正常生理活动,从而起到抗肝癌作用。

全文目录


摘要  4-7
Abstract  7-11
缩略词表  11-17
第一章 文献综述及选题背景和研究目的  17-30
  1 肝癌及其防治研究概况  17-23
    1.1 肝癌发病原因  17-19
      1.1.1 肝炎病毒  17-18
      1.1.2 黄曲霉毒素  18
      1.1.3 饮水污染  18-19
      1.1.4 烟酒过量  19
      1.1.5 其它因素  19
    1.2 肝癌的分类  19-21
      1.2.1 原发性肝癌  19
      1.2.2 肝细胞癌  19-20
      1.2.3 肝内胆管细胞癌  20
      1.2.4 转移性肝癌  20-21
      1.2.5 继发性肝癌  21
    1.3 肝癌的防治研究概况  21-23
      1.3.1 外科手术  21-22
      1.3.2 放射治疗  22
      1.3.3 药物治疗  22-23
  2 油樟的研究概况  23-27
    2.1 油樟生物学特性研究  23-24
    2.2 油樟叶的化学成分研究  24-25
    2.3 油樟生物学功能研究  25-27
      2.3.1 抗菌活性  25-26
      2.3.2 抗炎镇痛  26
      2.3.3 抗病毒  26-27
      2.3.4 抗癌作用  27
  3 研究的目的意义  27-30
第二章 油樟叶提取物体外抗肝癌细胞活性研究  30-46
  1 材料与方法  30-34
    1.1 材料  30-31
      1.1.1 植物材料  30
      1.1.2 细胞与培养基  30-31
      1.1.3 主要仪器设备  31
      1.1.4 实验试剂  31
    1.2 方法  31-34
      1.2.1 油樟叶乙醇提取物及其不同极性溶剂萃取物的制备  31-32
      1.2.2 油樟叶挥发油各组成成分的制备  32
      1.2.3 油樟叶各提取物的稀释  32-33
      1.2.4 肝癌BEL-7402细胞的培养  33
      1.2.5 油樟叶各提取物的体外抗肝癌活性  33-34
        1.2.5.1 MTT法测定油樟叶提取物对肝癌细胞体外增殖的抑制作用  33
        1.2.5.2 油樟叶提取物对肝癌细胞体外集落形成的抑制作用  33-34
    1.3 数据统计与分析  34
  2 结果与分析  34-43
    2.1 油樟叶提取物对肝癌细胞体外增殖的抑制结果  34-41
      2.1.1 油樟叶乙醇提取物及各极性萃取物对肝癌细胞体外增殖的抑制结果  34-37
      2.1.2 油樟叶挥发油及主要组成成分对肝癌细胞体外增殖的抑制结果  37-40
      2.1.3 油樟叶提取物抗人肝癌BEL-7402细胞的药效学评价  40-41
    2.2 油樟叶各提取物对肝癌细胞体外集落形成抑制的结果  41-43
      2.2.1 油樟叶乙醇提取物及各极性萃取物对肝癌细胞体外集落形成抑制的结果  41-42
      2.2.2 油樟叶挥发油及主要组成成分对肝癌细胞体外克隆抑制的结果  42-43
  3 讨论  43-46
第三章 黄樟油素对人肝癌细胞的作用机理研究  46-57
  1 材料与方法  47-49
    1.1 材料  47
      1.1.1 细胞与培养基  47
      1.1.2 植物材料  47
      1.1.3 主要仪器设备  47
    1.2 方法  47-49
      1.2.1 黄樟油素溶液的制备  47
      1.2.2 细胞的培养  47
      1.2.3 黄樟油素对人肝癌BEL-7402细胞形态学的影响  47-48
        1.2.3.1 黄樟油素对人肝癌BEL-7402细胞组织形态的影响  47-48
        1.2.3.2 黄樟油素对BEL-7402细胞超微结构的影响  48
      1.2.4 黄樟油素对人肝癌BEL-7402细胞周期分布和细胞凋亡的影响  48
      1.2.5 黄樟油素对人肝癌BEL-7402细胞DNA的影响  48-49
    1.3 数据处理  49
  2. 结果与分析  49-53
    2.1 黄樟油素对BEL-7402细胞形态的影响  49-50
      2.1.1 黄樟油素对人肝癌BEL-7402细胞组织形态的影响  49
      2.1.2 黄樟油素对BEL-7402细胞超微结构的影响  49-50
    2.2 黄樟油素对人肝癌BEL-7402细胞周期分布和细胞凋亡的影响  50-52
      2.2.1 黄樟油素对人肝癌BEL-7402细胞周期的影响  50-51
      2.2.2 黄樟油素对人肝癌BEL-7402细胞凋亡的影响  51-52
    2.3 黄樟油素对人肝癌BEL-7402细胞DNA的影响  52-53
  3. 讨论  53-57
    3.1 黄樟油素对人肝癌BEL-7402细胞形态学的影响  53-54
    3.2 黄樟油素对人肝癌BEL-7402细胞周期的影响  54-55
    3.3 黄樟油素对人肝癌BEL-7402细胞凋亡率的影响  55
    3.4 黄樟油素对人肝癌BEL-7402细胞DNA的影响  55-57
第四章 γ-松油醇对人肝癌细胞的作用机理研究  57-66
  1 材料与方法  57-60
    1.1 材料  57-58
      1.1.1 细胞与培养基  57
      1.1.2 植物材  57-58
      1.1.3 主要仪器设备  58
    1.2 方法  58-59
      1.2.1 γ-松油醇溶液的制备  58
      1.2.2 细胞的培养  58
      1.2.3 γ-松油醇对人肝癌BEL-7402细胞形态学的影响  58-59
        1.2.3.1 γ-松油醇对人肝癌BEL-7402细胞组织形态的影响  58
        1.2.3.2 γ-松油醇对BEL-7402细胞超微结构的影响  58-59
      1.2.4 γ-松油醇对人肝癌BEL-7402细胞周期分布和细胞凋亡的影响  59
      1.2.5 γ-松油醇对人肝癌BEL-7402细胞DNA的影响  59
    1.3 数据处理  59-60
  2 结果与分析  60-64
    2.1 γ-松油醇对BEL-7402细胞形态的影响  60
      2.1.1 γ-松油醇对人肝癌BEL-7402细胞组织形态的影响  60
      2.1.2 γ-松油醇对BEL-7402细胞超微结构的影响  60
    2.2 γ-松油醇对人肝癌BEL-7402细胞周期分布和细胞凋亡的影响  60-63
      2.2.1 γ-松油醇对人肝癌BEL-7402细胞周期的影响  60-62
      2.2.2 γ-松油醇对人肝癌BEL-7402细胞凋亡的影响  62-63
    2.3 γ-松油醇对人肝癌BEL-7402细胞DNA的影响  63-64
  3 讨论  64-66
    3.1 γ-松油醇对人肝癌BEL-7402细胞形态学的影响  64
    3.2 γ-松油醇对人肝癌BEL-7402细胞周期和凋亡率的影响  64-65
    3.3 γ-松油醇对人肝癌BEL-7402细胞DNA的影响  65-66
第五章 结论与创新  66-67
  1、结论  66
  2、创新  66-67
参考文献  67-76
致谢  76-77
发表和形成的主要研究文章  77-78
附图  78-83

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肝肿瘤
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