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疏风凉血补肾法干预下CITP患者PD-1/PD-L变化规律的研究

作　者: 解国品
导　师: 陈志雄
学　校: 广州中医药大学
专　业: 中医学
关键词: 疏风凉血补肾法(方) 免疫性血小板减少性紫癜负性协同刺激分子细胞因子
分类号: R259
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的：免疫性血小板减少性紫癜(Immune thrombocytopenic purpura, ITP)是一种自身免疫性出血性疾病,临床表现为外周血小板(blood platelet, PLT)计数下降,皮肤出血点、紫斑,粘膜和(或)内脏出血等症状,中医认为该病可归属于“血证”、“肌衄”、“发斑”等范畴。目前对ITP发病机制的研究尚未完全明晰,根据多方的深入研究,发现作为一种自身免疫性疾病,细胞免疫紊乱是ITP除体液免疫外重要的发病机制之一,而目前这一研究领域逐渐引起众多的关注。作为细胞免疫重要的组成部分,协同刺激分子可调节淋巴细胞的活化程度,即可使淋巴细胞不断保持在激活状态,又可使淋巴细胞避免过度活化,目前研究发现多种免疫性疾病其发生发展与协同刺激分子表达的失衡关系密切。协同刺激分子有正性与负性之分,过度活化的T淋巴细胞、异常分泌的多种细胞因子,往往与正性协同刺激分子过度表达有关,继而造成B淋巴细胞过度增殖活化,促进抗血小板相关抗体分泌,引起血小板过度破坏；而机体在T淋巴细胞的活化增殖与细胞因子的分泌方面常为负性协同刺激分子所抑制。CD4+亚群(Th细胞)根据自身所分泌的细胞因子,分为Th1和Th2两个亚群,Thl主要分泌IL-2、IFN-γ等细胞因子,主要介导细胞免疫；Th2分泌IL-4、IL10等细胞因子,主要介导体液免疫：Th1和Th2分泌的细胞因子既可促进自身增殖,又能抑制对方细胞因子分泌,并且在一定条件下Th1/Th2功能还可向对方转换。Th1/Th2的平衡是机体免疫功能得以正常维持的重要条件,多种免疫性疾病的发生发展与其平衡失调、细胞因子异常分泌密切相关。本实验研究从临床入手,在疏风凉血补肾法(方)干预下,采用流式细胞术(Flow CytoMeter, FCM)及酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA),通过检测患者外周血PD-1、PD-L1、sPD-1的表达及与免疫密切相关的Thl/Th2细胞因子IL-2、IL-10的水平变化,在分子水平上研究ITP患者PD-1/PD-L负性协同刺激通路的表达关系及对T细胞功能的影响,阐述其机制,探讨慢性免疫性血小板减少性紫癜(Chronic Immune Thrombocytopenic Purpura, CITP)的发病机理。在此基础上,重点观察祛风凉血补肾法(方)干预下,探讨PD-1、PD-L1与sPD-1之间的关系,并进一步探究负性协同刺激通路PD-1/PD-L与ITP的相互关系,以丰富ITP的中医治疗理论,探寻有效治疗免疫性疾病的中医药理论。方法：临床研究予18例健康对照组。将符合CITP诊断标准和纳入标准的18例患者编为CITP组,予祛风凉血补肾法(方)干预治疗,若需激素者继续加激素治疗(强的松治疗,0.5-1mg/(kg.d))。若出现外感症状,加用解表药物。以4周为一疗程,每治疗一疗程后抽取外周血观测,连续观察3个疗程,观察血小板计数变化,外周血协同刺激分子PD-1、PD-L1.sPD-1的表达以及细胞因子IL-2、IL-10的水平变化情况。结果：临床研究结果1. CITP组血小板计数、PD-1表达均明显低于健康组(P<0.01),sPD-1、IL-2、IL-10表达明显高于健康组(P<0.01),CITP组与健康组在PD-L1表达方面未见明显差异(P＞0.05)。2.CITP组sPD-1、IL-2、IL-10三者间存在正相关(相关系数r趋向于+1,P均<0.01)；3.CITP组经疏风凉血补肾法(方)治疗后,PLT较治疗前无明显变化,治疗前后比较无统计学意义(P>0.05),与健康组比较,治疗前后均具有显著统计学意义(P<0.01)。4.CITP组经疏风凉血补肾法(方)治疗,PD-1表达较治疗前增加,两组比较未达到统计学意义(P>0.05),治疗前PD-1表达与健康组达到显著统计学意义(P<0.01)；治疗后PD-1表达与健康组比较未达到统计学意义(P>0.05)；5.CITP组经疏风凉血补肾法(方)治疗,在PD-L1方面,治疗后与治疗前无明显变化,治疗前后比较无统计学意义(P>0.05),与健康组比较无统计学意义(P>0.05)。6.CITP组经疏风凉血补肾法(方)治疗,在sPD-1表达方面,治疗后较治疗前明显减少,治疗前后比较有显著统计学意义(P<0.01),与健康组比较均有显著统计学意义(P<0.01)。7.CITP组经疏风凉血补肾法(方)治疗,在IL-2表达方面,治疗后较治疗前明显减少,治疗前后比较有显著统计学意义(P＜0.01)；治疗前后IL-2表达均高于健康组,与健康组相比较均有显著统计学意义(P＜0.01)。8. CITP组经疏风凉血补肾法(方)治疗,在IL-10表达方面,治疗后较治疗前明显减少,治疗前后比较有统计学意义(P＜0.05)；治疗前后与健康组比较均有显著统计学意义(P＜0.01)。结论：CITP免疫功能存在紊乱现象,负性协同刺激分子通路PD-1/PD-L发生异常,sPD-1过度表达,PD-1低表达,抑制信号减弱,导致失去正常抑制的正性协同刺激分子过度表达,促进T淋巴细胞数量增加和活化程度增强,引起抗自身免疫强烈的反应,导致T细胞亚群Th1/Th2出现平衡紊乱、细胞因子分泌异常,从而使活化的B细胞出现异常增加,促进抗血小板相关抗体分泌,引起血小板过度破坏,导致ITP发生。疏风凉血补肾法(方)可调节协同刺激分子的表达,通过上调负性协同刺激分子PD-1的表达,降低sPD-1表达,降低细胞因子IL-2、IL-10的表达水平,调节Th1/Th2细胞间的平衡,抑制自身免疫过度反应,减少抗血小板相关抗体过度分泌引起的血小板大量破坏。因此治疗CITP,可从促进负性协同刺激通路PD-1/PD-L的正常表达,调节T淋巴细胞亚群Th1/Th2的平衡状态,调控相关细胞因子分泌,调节免疫失衡状态等方面出发,深入研究中西医结合治疗CITP的理论依据,具有重要的临床价值。

全文目录

中文摘要  3-6
Abstract  6-12
引言  12-16
第一部分文献研究  16-42
  第一节 CITP的中医研究  16-26
    一、古代医家对CITP的认识与研究  16-20
    二、现代医家对CITP认识与研究  20-26
  第二节 CITP现代医学的相关研究  26-39
    一、PD-1/PD-L与CITP的关系  26-33
    二、Th1/Th2及其细胞因子(IL-2、IL-10)与CITP的关系  33-36
    三、CITP的西医治疗  36-39
  第三节祛风凉血补肾法治疗CITP的相关研究  39-42
    一、疏风凉血补肾法治疗ClTP的理论基础  39-40
    二、疏风凉血补肾法治疗CITP的实验研究  40
    三、中医药关于CITP中协同刺激通路的相关研究  40
    四、关于CITP协同刺激信号通路平衡异常的假说  40-42
第二部分实验研究  42-57
  第一节临床研究  42-46
    一、材料和方法  42-44
    二、检测指标  44-45
    三、统计方法  45-46
  第二节结果与分析  46-56
    一、病例资料分析  46
    二、健康组与CITP组各指标比较  46-50
    三、CITP组sPD-1、IL-2、IL-10各指标间相关性分析  50-52
    四、CITP组疏风凉血补肾法(方)治疗前后各指标比较  52-56
  第三节总结  56-57
第三部分讨论  57-63
  一、观察指标及临床意义  57
  二、疏风凉血补肾法(方)方解及相关现代药理研究  57-59
  三、疏风凉血补肾法(方)对PD-1/PD-L负性调控通路及相关细胞因子的影响  59-63
结语  63-65
参考文献  65-77
附录  77-82
在校期间发表论文和参与研究情况  82-83
致谢  83

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