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芥子气染毒体内生物标志物—血红蛋白加合物及尿液中代谢产物的鉴定、检测及应用研究
作 者: 聂志勇
导 师: 谢剑炜
学 校: 中国人民解放军军事医学科学院
专 业: 药物分析学
关键词: 芥子气 生物标志物 血红蛋白 固相萃取 N-(2-羟基乙基硫代乙基)-缬氨酸 硫二甘醇 硫二甘醇亚砜 负离子化学电离-气相色谱/质谱联用仪
分类号: R114
类 型: 博士论文
年 份: 2011年
下 载: 67次
引 用: 0次
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内容摘要
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芥子气(HD,2, 2’-二氯二乙硫醚)是一种糜烂性化学战剂,能造成皮肤、眼睛及呼吸系统的损伤,在第一次世界大战和中东战争中多次使用,二战期间,日本帝国主义军队对中国军民使用了包括芥子气在内的大量化学武器,日军二战战败后在中国遗弃了大量的化学武器,其中大部分为芥子气和芥路混合毒剂,这些毒剂至今仍严重影响和威胁着当地环境及居民安全与健康。芥子气有两个亲电碳原子,是典型的双功能烃化剂,生理条件下,可与体内多种亲核基团如氨基、巯基、羟基、羧基、磷酸基及咪唑基等反应,产生广泛复杂的生物学作用。虽然芥子气作用机制早有研究,但迄今尚未完全阐明;而芥子气染毒后很难治愈,且可能造成遗传毒性,所以对芥子气的作用机制的研究仍具有重要的现实意义。芥子气损伤与烧伤及其它化学试剂损伤的症状相似,临床确诊比较困难,所以芥子气中毒诊断也需要明确的确证指标。芥子气进入体内后,与体内亲核基团反应后产生一系列的代谢及加合产物,在血液、尿液及各组织中形成芥子气中毒特有的生物标志物。血液及尿液中的游离代谢产物可以作为芥子气损伤的标志物,但由于短期内就被排出体外,所以在溯源性方面存在着一些不足;而芥子气与大分子如蛋白、核酸等的加合产物在体内稳定性好、存在时间长,可作为芥子气中毒确证的长效标志物进行溯源性分析及毒理机制研究。而由于芥子其中毒标志物在生物样品中含量低、生物基质复杂及参考品难制备等因素,对分析检测工作产生了巨大的挑战。本研究在选取研究对象时,首先考虑了血红蛋白加合物,因为血液中血红蛋白代谢周期长(120天)、含量丰富,具有理想长效生物标志物的潜在特点,对溯源性分析非常有利。其次是尿液中的硫二甘醇(TDG)、硫二甘醇亚砜(TDGO),因为它们在中毒早期主要来自于HD的直接水解或水解氧化,转化过程比较简单,所以相比于其它游离代谢物,对于芥子气早期中毒损伤程度的快速判断更有重要的实际应用价值;而且从目前研究来看,大部分的HD体内标志物在中毒中后期都可能最终代谢成为TDG或TDGO,这对于了解芥子气中毒后的代谢行为研究也有着重要意义。所以本论文以血液中的血红蛋白N端加合物(HETE-Val)及尿液中的TDG、TDGO为研究对象,首先建立了灵敏的同位素稀释-NCI-GC/MS分析方法,继而进行了体内外染毒实验,探讨了它们在体内的分布及代谢行为。本论文分为以下六章。第一章为前言部分,重点围绕芥子气中毒产生的水解/氧化产物、谷胱甘肽、蛋白及DNA加合物等四种类型,对芥子气的中毒机制、中毒后产生的各种生物标志物、标志物的检测手段、HD在体内的分布和代谢行为等进行了综述;同时比较了文献关注的一些问题,进而提出归纳了本研究论文的意义、内容与创新点。第二章改进了HETE-Val参考品的合成路线,建立了HETE-Val相关化合物的合成路线,并对这些合成产物进行了GC、GC/MS、LC/MS、核磁鉴定及纯度分析,得到了理想的结果。由于生物样品处理过程复杂、繁琐,每一个步骤都可能对最终的定量结果造成影响,要避免或减少各方面的影响,比较好的办法是加入同位素内标,所以本研究又建立了氘代半芥及氘代芥子气(HD-d4)的微量合成路线,纯度达到96%以上,氘代率近100%(未发现HD-d0),以氘代芥子气为基础制备了HETE-Val的氘代同位素内标,以氘代半芥为基础,建立了N7-HETEG-d4的合成路线;氘代内标的制备为方法的稳定性及定量的准确性提供了有力的保障。第三章以HD体外染毒后血液中的HETE-Val为研究对象,以合成的参考品为基础,进行了Edman降解、SPE净化、HFBI衍生化等条件的考察和优化,建立了灵敏的检测方法,当芥子气体外染毒量为20 nmol/L时即可明显检出HETE-Val,即LOD为20 nmol/L (S/N>3),相比于文献,在相同仪器条件下,灵敏度提高了近10倍,最低定量限(LOQ)为100 nmol/L (S/N>10),接着考察了芥子气体外全血染毒后HETE-Val含量与HD染毒浓度之间的关系,染毒浓度为0.1μmol/L–120μmol/L,结果显示,HETE-Val含量与HD染毒浓度呈一个近似线性的关系,HD与血红蛋白N端缬氨酸的反应稳定、而且反应比例基本固定,通过计算,与血红蛋白N端缬氨酸的反应的HD占HD体外染毒总量的1%-2%。第四章基于已建立的同位素稀释-NCI-GC/MS检测方法,选择了与人皮肤HD中毒的LD50值较为一致的家兔为研究对象,进行了皮肤暴露HD染毒实验,监测了染毒后血液中的HETE-Val;结果显示,家兔HD皮肤染毒三个剂量组的加合物(HETE-Val)与染毒剂量有很好的量效关系,时效关系也很明显。各染毒剂量组在染毒15min后即有HETE-Val产生,2天内有增加的趋势,2-9天趋于稳定,然后逐渐减少,而第103天仍可监测到HETE-Val。通过研究发现,家兔HD皮肤染毒模型中,与珠蛋白N端缬氨酸反应的HD占HD染毒总量的0.15‰左右,进入家兔血液系统且与家兔血液反应的HD只占家兔染毒总量的1%左右。第五章通过研究和改进SPE等前处理手段,成功建立了尿液中TDG及TDGO的提取净化方法,同时就文献关注的TDG衍生化后产物过于复杂,影响检测灵敏度等问题进行了探讨和净化处理,最终方法的LOD达到0.1 ng/mL,灵敏度比文献(相同仪器条件)提高了10倍,LOD达到0.3 ng/mL。基于建立的同位素稀释-NCI-GC/MS检测方法,以家兔皮肤HD染毒后的尿样为样本,监测了TDG及TDG+TDGO的变化趋势;结果显示,家兔染毒后尿液中TDG及TDG+TDGO迅速升高,然后在2日内又快速下降,各中毒剂量组在染毒第3-7日内TDG+TDGO的单日排出量持续减少然后趋于稳定。尿液中TDG及TDGO的异常升高可以做为HD损伤的一个重要指标,而TDG及TDGO的含量也可以做为HD损伤程度的一个重要参考。尿液中TDGO含量比TDG含量高,排出的总TDG只约占总TDG+TDGO量的2%-3%,而葡萄糖醛酸化及硫酸酯化的TDG及TDGO均很少。第六章,由于河北省某地建筑工人不明化学品(疑似HD)意外中毒,本章以建立的尿液中TDG及TDG+TDGO的检测方法为基础,进行了快速鉴定和检测;结果显示,患者尿液中的TDG及TDG+TDGO的含量明显高于背景值,确证为芥子气染毒,而各患者的TDG及TDG+TDGO含量与其相应的中毒症状吻合。随后对患者尿液中的TDG及TDG+TDGO的代谢行为进行了考察,结果显示,TDG及TDG+TDGO的变化趋势与家兔皮肤HD染毒模型相似,TDGO含量比TDG的含量高很多,而且TDG与TDGO在人体内的葡萄糖醛酸化及硫酸酯化也都很少;由此我们得出,第五章建立的尿液中TDG及TDGO的检测方法在人员HD中毒诊断中有很好的应用价值,而家兔皮肤HD染毒模型在人员中毒研究方面具也有很好的参考价值。
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全文目录
缩略词表 9-12
摘要 12-15
Abstract 15-19
第一章 前言 19-33
1.1 概述 19-20
1.2 化学反应机理 20-22
1.3 各种芥子气中毒生物标志物的检测技术的研究进展 22-29
1.3.1 水解、氧化产物的检测技术 22-23
1.3.1.1 硫二甘醇（TDG） 22-23
1.3.1.2 硫二甘醇亚砜（TDGO） 23
1.3.2 芥子气-谷胱甘肽加合物及其裂解产物 23-24
1.3.2.1 SBSANE 24
1.3.2.2 β-裂解产物 24
1.3.3 芥子气与蛋白质的共价加合物 24-27
1.3.3.1 血红蛋白 25-26
1.3.3.2 芥子气的白蛋白加合物 26
1.3.3.3 角蛋白加合物 26-27
1.3.3.4 血液总蛋白 27
1.3.4 芥子气与DNA 的加合物 27-29
1.3.4.1 反应位点 27-28
1.3.4.2 分析方法 28
1.3.4.3 染毒人员的应用 28-29
1.4 芥子气中毒后在体内的分布及代谢 29-31
1.4.1 分布 29
1.4.2 代谢 29-31
1.5 本论文研究的意义、内容与创新点 31-33
第二章 参考品及同位素内标的合成制备 33-57
2.1 引言 33
2.2 仪器与试剂 33-35
2.2.1 主要仪器 33-34
2.2.2 试剂 34
2.2.3 仪器分析条件 34-35
2.2.3.1 GC-MS(CI)分析条件 34-35
2.2.3.2 GC-MS(EI)分析条件 35
2.2.3.3 GC-FID 分析条件 35
2.2.3.4 LCT 分析条件 35
2.3 实验部分 35-40
2.3.1 溶液的配制 35-36
2.3.2 HETE-Val 及其相关化合物的合成及鉴定 36-38
2.3.2.1 半芥的制备及鉴定 36
2.3.2.2 HETE-Val 的制备及鉴定 36-37
2.3.2.3 HETE-Val 与Edman 试剂的反应 37
2.3.2.4 HFBI 衍生化HETE-Val-P 37-38
2.3.3 氘代同位素内标的合成 38-40
2.3.3.1 氘代芥子气的合成（HD-d4）及鉴定 38-39
2.3.3.2 制备用于分析HETE-Val 的同位素内标 39
2.3.3.3 合成氘代N7-HETEG（N7-HETEG-d4） 39-40
2.3.4 实验过程中的防护及洗消 40
2.4 结果与讨论 40-42
2.4.1 合成HETE-Val 及相关化合物 40-41
2.4.2 微量合成HD-d4 41
2.4.3 HETE-Val 同位素内标 41
2.4.4 合成N7-HETEG-d4 41-42
2.4.5 参考品的谱图解析 42
2.5 本章小结 42-43
附图 43-56
附表 56-57
第三章 血液体外HD 染毒后HETE-Val 的检测 57-72
3.1 引言 57-58
3.2 仪器与试剂 58-59
3.2.1 主要仪器 58
3.2.2 试剂 58-59
3.2.3 仪器分析条件 59
3.3 实验部分 59-62
3.3.1 溶液的配制 59
3.3.2 固相萃取条件的选择和优化 59-60
3.3.2.1 制备基质 60
3.3.2.2 淋洗条件的考察优化 60
3.3.2.3 SPE 填料的考察优化 60
3.3.3 HETE-Val 检测方法学的考察 60-62
3.3.3.1 Edman 降解效率 60-61
3.3.3.2 SPE 回收率 61
3.3.3.3 衍生化效率 61
3.3.3.4 工作曲线的制作 61
3.3.3.5 方法的精密度及回收率 61-62
3.3.3.6 血样HD 染毒后HETE-Val 的鉴定与样品检测的稳定性 62
3.3.3.7 检测限与定量限 62
3.3.4 血液HD 染毒后HETE-Val 的检测 62
3.4 结果与讨论 62-70
3.4.1 固相萃取条件的优化选择 62-64
3.4.1.1 淋洗条件的考察优化 62-64
3.4.1.2 SPE 填料的考察优化 64
3.4.2 HETE-Val 检测的方法学考察结果 64-68
3.4.2.1 Edman 降解效率 64-65
3.4.2.2 SPE 回收率 65
3.4.2.3 衍生化效率 65
3.4.2.4 工作曲线的制作 65-66
3.4.2.5 方法的精密度及回收率 66
3.4.2.6 血样HD 染毒后HETE-Val 的鉴定与样品检测的稳定性 66-67
3.4.2.7 检测限与定量限 67-68
3.4.3 HETE-Val 检出量与血液HD 染毒浓度的关系 68-69
3.4.4 HETE-Val 与HD 染毒总量的关系 69-70
3.5 本章小结 70-72
第四章 家兔皮肤HD 染毒后HETE-Val 的监测 72-84
4.1 引言 72
4.2 仪器与试剂 72-74
4.2.1 主要仪器 72-73
4.2.2 试剂 73
4.2.3 GC-MS(CI)分析条件 73-74
4.3 实验动物 74
4.4 实验部分 74-75
4.4.1 配制溶液 74
4.4.2 动物染毒及样品采集 74-75
4.4.2.1 家兔皮肤暴露染毒 74-75
4.4.2.2 采集血样 75
4.4.2.3 采集尿样 75
4.4.3 家兔HD 皮肤染毒后血液中HETE-Val 的监测 75
4.4.3.1 工作曲线的制作 75
4.4.3.2 HETE-Val 的监测 75
4.5 结果与讨论 75-80
4.5.1 工作曲线的绘制 75-76
4.5.2 家兔皮肤HD 染毒后HETE-Val 的时效与量效关系 76-77
4.5.3 HETE-Val 与HD 染毒总量的关系 77-78
4.5.4 由内标推算与血液反应的HD 与家兔皮肤HD 染毒总量的关系 78-79
4.5.5 家兔皮肤症状与HD 染毒剂量的关系 79-80
4.6 本章小结 80-81
附图 81-84
第五章 家兔HD 染毒后尿液中代谢产物的监测 84-102
5.1 引言 84
5.2 仪器与试剂 84-86
5.2.1 主要仪器 84-85
5.2.2 试剂 85-86
5.2.3 GC-MS(CI)分析条件 86
5.2.4 实验动物样品 86
5.3 实验部分 86-89
5.3.1 配制溶液 86-87
5.3.2 样品处理条件的考察优化 87-88
5.3.2.1 尿样中TDG 固相萃取条件的选择优化 87
5.3.2.2 尿样中TDGO 还原条件的考察 87
5.3.2.3 尿样中TDGO 还原后固相萃取条件的考察 87
5.3.2.4 TDG 衍生条件的选择 87
5.3.2.5 TDG 衍生化产物的固相萃取条件的考察优化 87-88
5.3.3 尿样中TDG 检测的方法学考察 88
5.3.3.1 工作曲线 88
5.3.3.2 精密度和回收率 88
5.3.3.3 检测限和定量限 88
5.3.4 尿样中TDG 与TDGO 总量（TDG+TDGO）检测的方法学考察 88-89
5.3.4.1 工作曲线 88
5.3.4.2 精密度和回收率 88-89
5.3.4.3 检测限和定量限 89
5.3.5 家兔皮肤HD 染毒后尿样中TDG 及TDG+TDGO 的监测 89
5.3.5.1 游离TDG 89
5.3.5.2 游离TDG+TDGO 89
5.3.5.3 游离TDG 及结合TDG 总量 89
5.3.5.4 游离TDG+TDGO 及结合TDG+TDGO 总量 89
5.4 结果与讨论 89-99
5.4.1 样品处理条件的考察优化 89-92
5.4.1.1 尿样中TDG 的SPE 条件的选择优化 89-90
5.4.1.2 尿样中TDGO 的还原条件的考察 90
5.4.1.3 尿样中TDGO 还原后固相萃取条件的考察 90
5.4.1.4 TDG 衍生条件的选择 90-91
5.4.1.5 TDG 衍生化产物固相萃取条件的考察优化 91-92
5.4.2 尿样中TDG 及TDGO 检测的方法学考察 92-93
5.4.2.1 工作曲线 92
5.4.2.2 精密度和回收率 92-93
5.4.2.3 检测限和定量限 93
5.4.3 尿样中TDG 与TDGO 总量（TDG+TDGO）检测的方法学考察 93-94
5.4.3.1 工作曲线 93
5.4.3.2 精密度和回收率 93-94
5.4.3.3 检测限和定量限 94
5.4.4 家兔皮肤HD 染毒后尿样中TDG 及TDG+TDGO 的监测 94-99
5.4.4.1 时效关系 94-96
5.4.4.2 量效关系 96-97
5.4.4.3 单日排出量随时间的变化 97-98
5.4.4.4 排出累加量随时间的变化 98-99
5.4.5 总TDG 及总TDG+TDGO 占HD 染毒量的比例 99
5.5 本章小结 99-102
第六章 HD 意外中毒患者尿样的检测研究 102-107
6.1 引言 102
6.2 仪器与试剂 102-103
6.2.1 主要仪器 102
6.2.2 试剂 102-103
6.2.3 GC-MS(CI)分析条件 103
6.3 患者尿样的采集与储存 103
6.4 实验部分 103-104
6.4.1 配制溶液 103
6.4.2 患者尿样的检测 103-104
6.5 结果与讨论 104-106
6.5.1 患者尿样中TDG 的检测结果 104
6.5.2 患者尿样中TDGO 的检测结果 104-105
6.5.3 患者中毒确证及尿样中TDG 与TDGO 的比较 105
6.5.4 检测结果与临床症状的比较 105
6.5.5 中毒剂量分析 105-106
6.6 本章小结 106-107
结论 107-110
参考文献 110-120
芥子气体内生物标志物的监测及其代谢与分布研究进展 120-137
参考文献 128-137
博士期间发表及参加会议交流文章 137-138
个人简历 138-139
致谢 139-140
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