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半滑舌鳎皮肤溃疡病病原及免疫保护研究

作　者: 姚志贤
导　师: 陈政强; 林茂
学　校: 集美大学
专　业: 水生生物学
关键词: 半滑舌鳎皮肤溃疡病病原疫苗免疫保护
分类号: S943
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis Günther）个体大、生长快、肉质鲜嫩、营养丰富，其品质和经济价值位居鳎类之首，当前，其人工养殖产业已初具规模，然而，养殖过程中出现的各类疾病则给养殖生产带来负面影响。皮肤溃疡病是近年来在养殖半滑舌鳎中新出现的一种细菌性疾病，本文对其病原进行研究，并以分离鉴定的致病菌为基础进行了灭活疫苗和减毒疫苗的制备及相关免疫保护效果探讨，目的在于了解该病原的生物学特性并为该病的绿色防控积累资料。从患有皮肤溃疡病的半滑舌鳎病灶分离得到4株优势菌，经人工注射感染证实菌株A3、BV1为引起养殖半滑舌鳎皮肤溃疡病的主要病原，其半数致死量LD₅₀分别为1.5×10^4.2cfu/mL、6.7×10³cfu/mL。对这2株致病菌进行了形态特征、理化特性、胞外产物酶活性与溶血活性及对抗菌类药物的敏感性等生物学性状的研究与分析。同时，测定它们的16SrRNA、gyrB基因序列，分析其相应序列的同源性并构建系统发育树，结合菌株A3、BV1的生理生化特征和16S rRNA、gyrB基因序列分析，确认这两株菌分别为哈维氏弧菌（Vibrioharveyi）和轮虫弧菌（V. rotiferianus）。胞外产物酶活性及溶血活性检测结果表明，菌株A3具有淀粉酶、尿素酶、脂肪酶、蛋白酶和卵磷脂酶活性而不具有明胶酶活性，在含有4%羊血的TSA平板上呈β溶血活性；菌株BV1具有淀粉酶、尿素酶、脂肪酶和卵磷脂酶活性，而不具有蛋白酶和明胶酶活性，在含有4%羊血的TSA平板上呈β溶血活性。药物敏感性分析结果显示，菌株A3对四环素、强力霉素、氟哌酸、磺胺异恶唑、氧氟沙星、新生霉素、萘啶酸、氟啶酸和左氧氟沙星敏感，而对其他抗生素低度敏感或具有一定的抗性；菌株BV1对链霉素、四环素、强力霉素、诺氟沙星、磺胺异噁唑、复方磺胺甲噁唑、萘啶酸和左氧氟沙星敏感，而对其他抗生素低敏或具有一定的抗性。以上述致病性哈维氏弧菌为抗原，采用福尔马林灭活方法制备了灭活疫苗并接种免疫半滑舌鳎，通过检测受免鱼的血清凝集抗体效价、溶菌酶活性、酸性磷酸酶活性、血清补体活性、血清蛋白含量、头肾白细胞吞噬杀伤活性等免疫相关指标及机体针对该病原攻毒后的免疫保护力，发现半滑舌鳎经疫苗免疫后35d内血清中抗体凝集效价呈现先升高后下降的趋势，但在免疫期间总体上保持较高的水平。同时，血清溶菌酶含量、酸性磷酸酶活性、血清蛋白含量与对照组相比都有明显的差异（P<0.05）。接种疫苗30d后的病原攻毒试验表明，受免半滑舌鳎的免疫保护力可达60%。由此可见，哈维氏弧菌灭活疫苗对半滑舌鳎有较显著的免疫保护效应，可作为预防哈维氏弧菌感染的疫苗。为了进一步探讨减毒活疫苗对半滑舌鳎的免疫保护效果，首先利用利福平筛选了具有利福平抗性的减毒株，并分析其相关生物学特性。利福平处理后获得的减毒株菌落较小、生长缓慢、运动性较弱，通过BIOLOG微生物鉴定系统检测该菌株对95种不同碳源的利用情况，结果显示野生菌株和减毒株的相似性为78.1%；在基因水平上，通过16S rRNA基因序列分析显示减毒株与野生菌株仅有一个碱基差异，表明筛选出来的减毒株在分类水平上并没有发生变化；REP-PCR分析则表明，减毒株与野生菌株具有相同的BOX和ERIC-PCR带型，而（GTG）5-PCR带型不同，减毒株的（GTG）₅-PCR图谱比野生菌株多一条；用Sackosyal法提取细菌外膜蛋白，用酚水法提取LPS，比较了减毒株与野生菌株的OMP和LPS的SDS-PAGE电泳图谱，结果显示减毒株的OMP和LPS带型与野生菌株不同，且条带数都明显减少。以上述具有利福平抗性的减毒株为免疫原经腹腔注射免疫半滑舌鳎并通过测定受免鱼的血清凝集抗体效价、溶菌酶含量、酸性磷酸酶活性、头肾白细胞吞噬杀伤活性、头肾白细胞呼吸爆发活性、头肾白细胞MPO活性和NO活性等免疫相关指标及病原攻毒后机体免疫保护力来评价减毒疫苗对半滑舌鳎的免疫保护效果，结果表明，接种疫苗后28d内受免半滑舌鳎的血清中抗体凝集效价呈先升高的趋势，同时，血清溶菌酶含量、酸性磷酸酶活性、吞噬杀伤活性、呼吸爆发活性、MPO和NO活性与对照组相比较都有明显的差异（P<0.05）。半滑舌鳎接种疫苗30d后的攻毒试验结果表明，受免鱼免疫保护力可达71.4%。不难看出，通过上述利福平处理后筛选出来的的哈维氏弧菌减毒株具有作为活疫苗的潜能，可刺激半滑舌鳎鱼体产生体液和细胞免疫应答并产生较为显著的免疫保护效果，可应用于由该病原引起的半滑舌鳎细菌性疾病的免疫防控。为了进一步探讨减毒活疫苗的制备方法，利用转座子插入突变法筛选半滑舌鳎皮肤溃疡性疾病病原减毒株。采用EZ-Tn⁵<KAN-2> Insertion Kit通过双亲本滤膜结合法将EZ-Tn5转座系统导入哈维氏弧菌感受态细胞中构建突变株，进而筛选出胞外蛋白酶和溶血素缺失突变株，通过PCR法鉴定发现Tn5转座子成功插入到了哈维氏弧菌基因组中，由此证明上述哈维氏弧菌胞外蛋白酶和溶血素缺失突变株确实是由于Tn5转座子插入所引起。上述突变株的获得无疑已为相关免疫保护研究和减毒活疫苗制备奠定了物质基础。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-14
第1章鳎类的疾病及免疫保护研究概况  14-25
  1.1 鳎类经济价值及主要养殖种类  14
  1.2 鳎类主要疾病及病原研究  14-20
    1.2.1 鳎类主要疾病类型及病原种类  14-18
    1.2.2 鳎类病原体研究概况  18-20
  1.3 疾病控制  20-22
    1.3.1 抗菌药物  20-21
    1.3.2 免疫增强剂  21-22
  1.4 免疫保护研究概况  22-25
    1.4.1 免疫机能及抗病基因的研究  22
    1.4.2 疫苗及应用  22-25
第2章半滑舌鳎皮肤溃疡病病原研究  25-43
  2.1 材料  25-26
    2.1.1 试验鱼  25
    2.1.2 主要药物及试剂  25
    2.1.3 主要仪器设备  25-26
  2.2 方法  26-30
    2.2.1 病原菌分离  26
    2.2.2 人工感染试验  26
    2.2.3 病原菌的鉴定  26-30
    2.2.4 胞外产物酶活性及溶血活性检测  30
    2.2.5 药敏试验  30
  2.3 结果与分析  30-40
    2.3.1 病鱼检查结果  30
    2.3.2 病原菌的分离及其形态特征  30-31
    2.3.3 人工感染试验结果  31-32
    2.3.4 生理生化特征  32-36
    2.3.5 16S rRNA 和 gyrB 基因序列分析及系统发育树构建  36-39
    2.3.6 胞外产物酶活性及溶血活性结果  39
    2.3.7 药敏试验  39-40
  2.4 讨论  40-43
第3章哈维氏弧菌灭活疫苗的制备及免疫保护的研究  43-55
  3.1 材料  43-44
    3.1.1 菌株  43
    3.1.2 试验鱼  43
    3.1.3 主要试验试剂  43-44
    3.1.4 主要仪器设备  44
  3.2 方法  44-48
    3.2.1 细菌培养  44
    3.2.2 灭活疫苗的制备  44
    3.2.3 疫苗的安全性检测  44
    3.2.4 半滑舌鳎免疫试验  44-45
    3.2.5 半滑舌鳎免疫保护力的测定  45
    3.2.6 血清的采集  45
    3.2.7 头肾白细胞的分离  45
    3.2.8 免疫指标的检测  45-48
    3.2.9 数据处理  48
  3.3 结果与分析  48-52
    3.3.1 疫苗制备及安全性检测  48
    3.3.2 免疫保护力测定  48
    3.3.3 血清凝集抗体效价  48-49
    3.3.4 血清溶菌酶活性  49-50
    3.3.5 血清 ACP 活性  50
    3.3.6 血清补体活性  50-51
    3.3.7 血清蛋白含量  51
    3.3.8 头肾白细胞吞噬杀伤活性  51-52
  3.4 讨论  52-55
    3.4.1 血清抗体效价和相对免疫保护力  52-53
    3.4.2 吞噬杀伤活性与免疫保护力  53
    3.4.3 溶菌酶活性  53
    3.4.4 ACP 活性  53
    3.4.5 血清补体活性  53-54
    3.4.6 血清蛋白含量  54-55
第4章哈维氏弧菌减毒活疫苗的制备及其特性研究  55-68
  4.1 材料  55-56
    4.1.1 菌株  55
    4.1.2 试验用药品及试剂  55-56
    4.1.3 主要试验器材  56
  4.2 方法  56-60
    4.2.1 减毒株的筛选  56
    4.2.2 表型及生理生化特征分析  56-57
    4.2.3 DNA 分析  57-58
    4.2.4 A3 与 A3RM 的脂多糖（LPS）和外膜蛋白（OMP）的比较分析  58-60
  4.3 结果与分析  60-66
    4.3.1 表型及生理生化特征分析  60-63
    4.3.2 DNA 分析  63-66
  4.4 讨论  66-68
第5章减毒活疫苗对半滑舌鳎的免疫保护研究  68-79
  5.1 材料  68-69
    5.1.1 菌株  68
    5.1.2 试验鱼  68
    5.1.3 主要试验试剂  68-69
    5.1.4 主要试验器材  69
  5.2 方法  69-73
    5.2.1 减毒菌株（A3RM）毒力分析  69
    5.2.2 减毒活疫苗对半滑舌鳎的免疫处理  69
    5.2.3 免疫保护力的测定  69
    5.2.4 血清的采集  69-70
    5.2.5 头肾白细胞的分离  70
    5.2.6 免疫指标的检测  70-72
    5.2.7 数据处理  72-73
  5.3 结果与分析  73-77
    5.3.1 减毒株的毒力分析  73
    5.3.2 免疫保护力测定  73
    5.3.3 血清抗体效价测定  73-74
    5.3.4 血清溶菌酶活性检测  74
    5.3.5 血清酸性磷酸酶（ACP）活性检测结果  74-75
    5.3.6 头肾白细胞吞噬杀伤活性检测结果  75
    5.3.7 头肾白细胞呼吸爆发活性检测结果  75-76
    5.3.8 头肾白细胞 MPO 活性检测结果  76
    5.3.9 头肾白细胞 NO 活性检测结果  76-77
  5.4 讨论  77-79
    5.4.1 鱼类的免疫接种途径对免疫保护力的影响  77-78
    5.4.2 血清抗体效价与免疫保护力的关系  78
    5.4.3 减毒活疫苗的免疫保护效果  78-79
第6章哈维氏弧菌 TN5 转座突变株的构建、筛选  79-87
  6.1 材料  79-80
    6.1.1 菌株  79
    6.1.2 主要试验试剂  79
    6.1.3 主要试验器材  79-80
  6.2 方法  80-83
    6.2.1 确定筛选哈维氏弧菌突变菌株所用卡那霉素的浓度  80
    6.2.2 制备转座复合体  80
    6.2.3 哈维氏弧菌感受态细胞的制备  80-81
    6.2.4 转座复合体与感受态细胞的结合  81
    6.2.5 转化子的筛选和培养  81
    6.2.6 突变株的表型筛选  81
    6.2.7 转座突变株的 PCR 鉴定  81-83
  6.3 结果与分析  83-85
    6.3.1 哈维氏弧菌 EZ-Tn5 突变株的构建与筛选  83
    6.3.2 胞外蛋白酶缺失突变体的筛选  83
    6.3.3 溶血素缺失突变体的筛选  83
    6.3.4 突变株的 PCR 鉴定  83-85
    6.3.5 序列测定结果  85
  6.4 讨论  85-87
    6.4.1 利用 Tn5 构建哈维氏弧菌突变株  85
    6.4.2 胞外蛋白酶和溶血素活性缺失突变株的构建、筛选和应用  85-87
小结与展望  87-88
致谢  88-90
参考文献  90-104
附录  104-110
在学期间发表的学术论文  110

半滑舌鳎皮肤溃疡病病原及免疫保护研究

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