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促性腺激素在雌性半滑舌鳎繁殖周期的生理功能研究

作　者: 王珊珊
导　师: 柳学周; 温海深
学　校: 中国海洋大学
专　业: 水产养殖
关键词: 半滑舌鳎促性腺激素 cDNA克隆荧光实时定量PCR RIA
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

本文以人工养殖半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis Günther）为研究对象，运用组织学、内分泌学方法、激素放射免疫测定方法以及分子生物学方法，对半滑舌鳎卵巢发育、促性腺激素（Gonadotropin Hormone, GtH）水平周期变化及其基因的克隆、表达水平等进行了系统的分析与研究，以期进一步阐明GtH的生理功能，为改善工厂化养殖鱼类的生殖调控提供有价值的参考信息。主要研究内容与结果如下：1.半滑舌鳎促性腺激素α亚基（CGα）基因的克隆及其时空表达分析采用RACE方法，从半滑舌鳎脑垂体中克隆了CGα全长cDNA。半滑舌鳎CGα基因全长为685bp，其开放阅读框为384bp，编码了含127个氨基酸的蛋白，N端33个氨基酸为信号肽。半滑舌鳎CGα成熟肽与其它脊椎动物CGα成熟肽结构特征相似，具有10个半胱氨酸残基和2个N-糖基化位点。CGα成熟肽序列分析表明，半滑舌鳎CGα与鲽形目和鲈形目鱼类CGα同源性最高为60-70%。实时荧光定量PCR结果表明，半滑舌鳎CGαmRNA在被检测的12个组织中均有表达，在垂体组织中大量表达，其次是鳃、肾脏、肌肉、卵巢和脑组织，在心脏、头肾、肝和脾等组织中只微量表达；对繁殖周期CGα表达水平进行测定有助于理解鱼类的分子调控机理。RT-PCR结果表明，繁殖周期雌性半滑舌鳎CGαmRNA在Ⅳ、Ⅴ期表达量最丰富。2.半滑舌鳎促滤泡激素（FSH）基因全长cDNA克隆、时空表达利用RT-PCR和RACE技术首次克隆得到半滑舌鳎FSH基因全长cDNA序列。全长为541bp，开放阅读框为393bp，编码130个氨基酸。发现一个N-糖基化位点：24-27NTT。与其它脊椎动物的FSH成熟肽氨基酸序列同源性比较表明：半滑舌鳎FSH与鲽形目和鲈形目鱼类FSH同源性最高为42-49%。实时荧光定量PCR组织表达分析表明，FSHmRNA除在垂体中大量表达外，其他组织也有表达，尤以脑、性腺表达量较高。半滑舌鳎FSHmRNA在垂体以外组织中的广泛表达，暗示FSH可能具有广泛的生理功能。RT-PCR方法对繁殖周期雌性半滑舌鳎FSH基因表达水平进行测定，结果表明，FSHmRNA在Ⅳ期表达量最丰富。3.半滑舌鳎促黄体激素（LH）基因全长cDNA克隆、时空表达利用RACE技术首次克隆了半滑舌鳎脑垂体中LH基因cDNA全长序列。该基因全长670bp，开放阅读框为477bp，编码158个氨基酸。与其它脊椎动物的LH成熟肽氨基酸序列同源性比较表明：半滑舌鳎LH与鲽形目和鲈形目同源性高58-68%。另外，半滑舌鳎LH含有12个保守的半胱氨酸残基和1个N-糖基化位点（19-21NQT）。实时荧光定量组织表达分析表明，LH mRNA在脑、垂体、鳃、心、头肾、肾、肝脏、脾脏、胃、肠、卵巢、肌肉这12组织中均有表达，垂体中表达量最丰富，其他组织尤以脑、性腺表达量较高。推测半滑舌鳎LH可能具有广泛的垂体外生理功能；RT-PCR方法对繁殖周期雌性半滑舌鳎LH表达水平进行测定，结果表明，LH mRNA在Ⅳ、Ⅴ期表达量最丰富。4.促性腺激素（GtH）含量测定及周年变化规律利用125I标记的放射免疫测定（RIA）技术检测繁殖周期半滑舌鳎血浆GtH浓度及周年变化规律。结果表明：FSH在繁殖周期的Ⅳ期表达量最丰富；而LH在Ⅴ期表达量最大。雌性半滑舌鳎血浆FSH和LH浓度的周年变化相似，呈现明显的周期性规律，都在9月时出现全年周期中的波峰。统计分析表明，FSH和LH与水温都呈正相关关系，表明调控水温能有效影响半滑舌鳎的生殖内分泌机制。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-14
前言  14-15
第一章文献综述  15-23
  1 硬骨鱼类促性腺激素相关研究概况  15-18
    1.1 鱼类促性腺激素的种类和结构  15-16
    1.2 鱼类促性腺激素的功能研究  16-17
    1.3 鱼类促性腺激素与受体结合特点  17-18
  2 半滑舌鳎繁殖生物学研究进展  18-21
    2.1 半滑舌鳎人工繁育研究进展  18-19
    2.2 半滑舌鳎性腺发育特征  19-21
      2.2.1 半滑舌鳎产卵类型  19
      2.2.2 半滑舌鳎卵母细胞时相划分  19-20
      2.2.3 半滑舌鳎卵巢发育分期  20-21
    2.3 半滑舌鳎生殖内分泌研究现状  21
  3 本研究的目的和意义  21-23
第二章半滑舌鳎促性腺激素α亚基全长 cDNA 克隆及表达特征分析  23-39
  1 材料和方法  23-29
    1.1 实验动物来源  23
    1.2 卵巢组织学分析  23-24
    1.3 总 RNA 提取  24-25
      1.3.1 实验前准备  24
      1.3.2 总 RNA 提取操作  24-25
    1.4 半滑舌鳎 CGα基因克隆  25-26
      1.4.1 cDNA 模板的合成  25
      1.4.2 半滑舌鳎 CGα基因保守片段的克隆  25
      1.4.3 CGα基因 cDNA 全长克隆  25-26
    1.5 序列分析  26-27
    1.6 RT-PCR 检测 CGαmRNA 组织表达差异  27-29
      1.6.1 cDNA 第一链合成  27-28
      1.6.2 CGα基因 RT-PCR 组织表达  28-29
    1.7 RT-PCR 检测 CGαmRNA 繁殖周期表达  29
      1.7.1 半滑舌鳎卵巢发育组织学  29
      1.7.2 cDNA 第一链合成  29
      1.7.3 CGα基因 RT-PCR 繁殖周期表达  29
  2 结果  29-36
    2.1 半滑舌鳎 CGα的 cDNA 全长克隆及序列分析  29-30
    2.2 CGα氨基酸序列比对及同源性分析  30-31
    2.3 CGα系统进化分析  31-32
    2.4 CGαmRNA 在不同组织的表达分析  32-33
    2.5 半滑舌鳎卵巢组织学及繁殖周期卵巢成熟系数变化  33-35
      2.5.1 半滑舌鳎卵巢发育组织学特征  33-34
      2.5.2 雌性半滑舌鳎卵巢成熟系数的繁殖周期变化  34-35
    2.6 CGαmRNA 在雌性半滑舌鳎繁殖周期的表达模式  35-36
  3 讨论  36-39
    3.1 半滑舌鳎 CGα亚基克隆及序列分析  36
    3.2 雌性半滑舌鳎 CGα mRNA 组织表达特征  36-37
    3.3 雌性半滑舌鳎 CGα mRNA 繁殖周期表达模式  37-39
第三章半滑舌鳎 FSH 全长 cDNA 克隆及表达特征分析  39-49
  1 材料和方法  39-42
    1.1 实验材料  39
    1.2 卵巢组织学分析  39
    1.3 总 RNA 提取  39
    1.4 半滑舌鳎 FSH 基因克隆  39-41
      1.4.1 cDNA 模板的合成  39
      1.4.2 半滑舌鳎 FSH 基因保守片段的克隆  39-40
      1.4.3 FSH 基因 cDNA 全长克隆  40-41
    1.5 序列分析  41
    1.6 RT-PCR 检测 FSH mRNA 组织表达差异  41-42
    1.7 RT-PCR 检测 FSH mRNA 繁殖周期表达  42
  2 结果  42-46
    2.1 半滑舌鳎 FSH 的 cDNA 全长克隆及序列分析  42-43
    2.2 FSH 氨基酸序列比对及同源性分析  43
    2.3 FSH 系统进化分析  43-44
    2.4 FSH mRNA 在不同组织的表达分析  44-45
    2.5 FSHmRNA 在雌性半滑舌鳎繁殖周期的表达模式  45-46
  3 讨论  46-49
    3.1 半滑舌鳎 FSH 基因克隆及序列分析  46-47
    3.2 雌性半滑舌鳎 FSHmRNA 组织表达特征  47
    3.3 雌性半滑舌鳎 FSHmRNA 繁殖周期表达模式分析  47-49
第四章半滑舌鳎 LH 全长 cDNA 克隆及表达特征分析  49-59
  1 材料和方法  49-51
    1.1 实验材料  49
    1.2 卵巢组织学分析  49
    1.3 总 RNA 提取  49
    1.4 半滑舌鳎 LH 基因克隆  49-50
      1.4.1 cDNA 模板的合成  49
      1.4.2 半滑舌鳎 LH 基因保守片段的克隆  49-50
      1.4.3 LH 基因 cDNA 全长克隆  50
    1.5 序列分析  50-51
    1.6 RT-PCR 检测 LH mRNA 组织表达差异  51
    1.7 RT-PCR 检测 LH mRNA 繁殖周期表达  51
  2 结果  51-56
    2.1 半滑舌鳎 LH 的 cDNA 全长克隆及序列分析  51-52
    2.2 LH 氨基酸序列比对及同源性分析  52-53
    2.3 LH 系统进化分析  53-54
    2.4 LH mRNA 在不同组织的表达分析  54-55
    2.5 LHmRNA 在雌性半滑舌鳎繁殖周期的表达模式  55-56
  3 讨论  56-59
    3.1 半滑舌鳎 LH 基因克隆及序列分析  56-57
    3.2 雌性半滑舌鳎 LH 基因在繁殖季节组织的表达特征  57
    3.3 雌性半滑舌鳎 LHmRNA 周期表达模式分析  57-59
第五章 GtH 激素含量测定及周年变化  59-66
  1 材料和方法  59-61
    1.1 实验动物  59
      1.1.1 血浆 FSH/LH 繁殖周期浓度测定  59
      1.1.2 血浆 FSH/LH 全年变化测定  59
    1.2 卵巢组织学分析  59
    1.3 激素测定  59-60
      1.3.1 标准曲线的制定  59-60
      1.3.2 激素测定  60
    1.4 数据分析  60-61
  2 结果  61-63
    2.1 雌性半滑舌鳎血浆 FSH 周期变化  61-62
      2.1.1 血浆 FSH 在雌性半滑舌鳎繁殖周期的变化规律  61
      2.1.2 雌性半滑舌鳎血浆 FSH 全年变化规律  61-62
    2.2 雌性半滑舌鳎血浆 LH 周期变化  62-63
      2.2.1 血浆 LH 在雌性半滑舌鳎繁殖周期的变化规律  62-63
      2.2.2 雌性半滑舌鳎血浆 LH 全年变化规律  63
  3 讨论  63-66
    3.1 雌性半滑舌鳎血浆 FSH 周期变化规律  63-64
    3.2 雌性半滑舌鳎血浆 LH 周期变化规律  64-65
    3.3 血浆 GtH 表达与水温调控的关系分析  65-66
参考文献  66-78
附录  78-79
致谢  79-80
个人简历  80
发表的学术论文  80-81

促性腺激素在雌性半滑舌鳎繁殖周期的生理功能研究

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