低氧诱导因子1α (hypoxia inducible factor-la, HIF-la)是在低氧环境下广泛表达的真核细胞转录因子,在调节新陈代谢、发育、细胞存活、增殖和病理状况下都发挥着重要作用。目前对于HIF-1α的研究多集中于哺乳动物的心脑血管疾病、肿瘤、胚胎发育等生" />
学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

斑马鱼HIF-1α启动子活性分析及LPS和低氧对HIF-1α的诱导表达

作　者: 刘莎莎
导　师: 王焕岭
学　校: 华中农业大学
专　业: 水产养殖
关键词: 斑马鱼 低氧诱导因子1α 启动子分析 低氧 LPS
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 5次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


低氧诱导因子1α 的学位论文">低氧诱导因子1α (hypoxia inducible factor-la, HIF-la)是在低氧环境下广泛表达的真核细胞转录因子,在调节新陈代谢、发育、细胞存活、增殖和病理状况下都发挥着重要作用。目前对于HIF-1α的研究多集中于哺乳动物的心脑血管疾病、肿瘤、胚胎发育等生理病理方面,而鱼类与哺乳动物相比更容易受到低氧胁迫和污染的侵害,但是关于鱼类HIF-la的调节机制却知之甚少。在本研究中,以模式生物斑马鱼(Danio rerio)为研究对象,对斑马鱼HIF-1a启动子进行生物信息学分析,构建一系列启动子缺失体的真核表达载体分析启动子活性,并研究LPS (lipopoly saccharide)和低氧对HIF-1α基因表达的调节,探究鱼类低氧、炎症适应的分子机制。主要结果如下：1、斑马鱼HIF-1α基因启动子的生物信息学分析通过生物学信息学软件对斑马鱼HIF-1α启动子进行分析,genomatix的gene2promoter程序预测在-651bp至+102bp处是启动子区域,结合这个结果我们通过设计引物,选择-1578至+97的1675bp启动子序列进行下一步研究。CpG Island Searcher预测CpG岛位于-97bp至+403bp处,MethPrime预测CpG岛位于-173bp至+38bp处,显示斑马鱼HIF-1α含有CpG岛。对所选1675bp启动子区进行转录因子预测发现其包括保守的调节元件CEBP (essential regulation elements CCAAT/enhancer binding protein)、STAT (signal transducer and activator of transcription)和E-box (enhancer box),以及应激炎症应答元件CREB (cAMP-responsive element binding proteins)、HSF (heat shock factors)和NF-κB (nuclear factor kappa B)等。通过对鲤科鱼类近端240bp序列进行比对发现其相似性高于82%。将转录因子进行比对后发现它们共同享有CAAT (CCAAT binding factors)、STAT, HIFF (hypoxia inducible factor)等转录因子。2、斑马鱼HIF-1α基因启动子缺失突变体的构建与活性分析设计引物通过PCR扩增斑马鱼HIF-1α系列启动子片段,常规分子生物学方法构建启动子的真核表达载体并进行启动子活性分析测定。结果成功构建6个不同长度的启动子真核表达载体。双荧光素酶测定结果显示最高的启动子荧光活性存在于pGL1-1中；但当转染pGL1-2和pGL1-3后荧光活性却几乎消失,说明-127到+97之间的序列很关键；当转染pGL2-1,pGL2-2和pGL2-3这些包含-127到+97序列的质粒后显示出很好的启动活性；说明我们所构建的最小启动子缺失体pGL2-3(-134至+97)包含最小核心启动子区。对-134至+97序列进行分析后发现此区间中存在很多顺势作用元件,例如E-box, CEBP, STAT,HSF,CREB等；在-1578到-930之间可能存在负性调控元件IRF(Interferon regulatory factor)和PRDI(positive regulatory domain I binding factor)。3、LPS及低氧对斑马鱼HIF-1α基因转录水平的调节常氧下用1μg/mL的LPS处理转染后的细胞后发现,只有pGL2-2和pGL2-3两个缺失体的活性有显著上升,其他缺失体的活性则没有明显变化,说明LPS在常氧下对HIF-1a的启动子活性并没有显著影响。常氧下用不同浓度的LPS处理斑马鱼幼鱼(3dpf)6h后发现,HIF-1a的mRNA水平在任何一个浓度范围内都没有显著变化。结果表明常氧下,在体内研究中LPS对HIF-lα的转录水平也没有显著影响。低氧下用不同浓度的LPS处理3dpf斑马鱼幼鱼后发现,仅在低氧条件下HIF-la的mRNA水平仍然没有显著变化。而在加入了各浓度的LPS后发现HIF-1α mRNA表达重随着LPS的浓度开始不断上升,10μg/mL的LPS显著激活了HIF-1α的mRNA水平。在时间进程实验中,低氧下用10μg/mL LPS处理斑马鱼幼鱼不同时间后,HIF-1α mRNA表达量在处理后3h开始缓慢上升,在第8h时上升到一个高峰。推测LPS和低氧在调节斑马鱼HIF-1a转录活性上存在一种协同机制。这种协同机制与鱼类的生存环境密切相关,因此更有益于鱼类的生存。

全文目录


摘要  6-8
Abstract  8-11
第一章 前言  11-19
  1 低氧诱导因子研究概况  11-13
    1.1 低氧诱导因子1的发现  11
    1.2 低氧诱导因子α的家族  11-12
    1.3 氧对HIF-1α亚基的调节  12-13
  2 HIF-1α的功能  13-16
    2.1 HIF-1α与新陈代谢适应  13-14
    2.2 HIF-1α与胚胎发育  14-15
    2.3 HIF-1α炎症反应  15-16
  3 低氧诱导因子1α在鱼类中的概况  16-17
  4 本研究的目的与意义  17-19
第二章 斑马鱼HIF-1α基因启动子的生物信息学分析  19-26
  1 材料与方法  19-20
    1.1 HIF-1α基因启动子序列的获取  19
    1.2 DNA片段的启动子预测  19
    1.3 DNA片段CpG岛的分析  19-20
    1.4 转录起始位点预测  20
    1.5 HIF-1α基因5’侧翼序列转录因子结合位点分析  20
    1.6 鲤科鱼类HIF-1α基因5’侧翼区序列对应比对  20
  2 结果  20-24
    2.1 启动子序列预测结果  20
    2.2 CpG岛预测结果  20-21
    2.3 转录起始位点预测结果  21-22
    2.4 转录因子结合位点预测结果  22-23
    2.5 鲤科鱼类HIF-1α基因5’侧翼区序列对应比对结果  23-24
  3 讨论  24-26
第三章 斑马鱼HIF-1α基因启动子缺失突变体的构建与活性分析  26-41
  1 材料与方法  26-34
    1.1 实验材料  26-28
      1.1.1 实验对象  26
      1.1.2 主要试剂及耗材  26-27
      1.1.3 主要仪器设备  27-28
    1.2 实验方法  28-34
      1.2.1 斑马鱼基因组DNA的提取  28
      1.2.2 PCR扩增斑马鱼HIF-1α基因5’-侧翼序列片段  28-30
      1.2.3 PCR产物的纯化回收  30
      1.2.4 PCR产物与pGL3-basic的双酶切  30-31
      1.2.5 酶切产物的纯化回收  31
      1.2.6 酶切后目的片段与载体的连接  31
      1.2.7 转化及阳性克隆的鉴定  31-32
      1.2.8 质粒抽提  32-33
      1.2.9 细胞培养  33
      1.2.10 质粒转染  33-34
      1.2.11 双荧光素酶报告基因检测  34
  2 结果  34-37
    2.1 斑马鱼基因组DNA的抽提  34-35
    2.2 斑马鱼HIF-1α基因系列截短突变体的5’侧翼序列PCR扩增  35-36
    2.3 斑马鱼HIF-1α基因系列5’侧翼序列系列荧光素酶报告基因表达载体的构建、测序及PCR鉴定  36-37
    2.4 斑马鱼HIF-1α基因系列5’侧翼序列系列截短缺失体的荧光素酶报告基因表达载体的活性测定  37
  3. 讨论  37-41
第四章 LPS及低氧对斑马鱼HIF-1α基因转录水平的调节  41-50
  1 材料与方法  41-45
    1.1 实验材料  41-42
      1.1.1 实验对象  41
      1.1.2 主要试剂及耗材  41-42
      1.1.3 主要实验设备  42
    1.2 实验方法  42-45
      1.2.1 质粒转染  42
      1.2.2 细胞样品的处理  42
      1.2.3 双荧光素酶报告基因检测  42
      1.2.4 斑马鱼仔鱼的处理及取样  42-43
      1.2.5 斑马鱼仔鱼总RNA的提取  43-44
      1.2.6 cDNA的合成  44
      1.2.7 斑马鱼HIF-1α基因的荧光定量检测  44-45
      1.2.8 数据统计  45
  2 结果  45-48
    2.1 常氧下LPS处理对HIF-1α系列启动子缺失体活性的影响  45-46
    2.2 常氧下LPS处理斑马鱼仔鱼对HIF-1α基因转录水平的影响  46
    2.3 低氧和LPS处理斑马鱼仔鱼对HIF-1α基因转录水平的影响  46-48
  3 讨论  48-50
参考文献  50-60
致谢  60

相似论文

  1. 喹喔啉-1，4-二氧化物衍生物的设计、合成及抗肿瘤活性研究,R914
  2. 斑马鱼肠道微细结构及肠粘膜屏障的研究,Q95-33
  3. β-防御素1基因在小鼠乳腺组织中表达的研究,S852.4
  4. 苏钟猪TLR4基因多态性及编码区C1027A功能分析,S828
  5. 慢性阻塞性肺疾病夜间血氧变化分析,R563.9
  6. 阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征低氧血症评价指标研究,R766
  7. 影响粒单细胞系HL-60细胞功能的血糖水平的探讨,R587.1
  8. 神经节苷脂对神经细胞脂多糖损伤保护作用机制的研究,R96
  9. 针刺对缺氧大鼠骨骼肌HIF-1和MHC亚型的影响,R245
  10. 雷公藤甲素对脂多糖大鼠急性肺损伤的保护作用及其机制研究,R285.5
  11. 慢性间歇低氧对小鼠海马CA1区神经元自噬的影响,R766.43
  12. 间歇低氧小鼠血清氧化应激指标的变化及N-乙酰半胱氨酸的治疗作用,R766.43
  13. 心肺复苏后大鼠脑组织低氧诱导因子-1α、水通道蛋白-4表达变化及β-七叶皂甙钠干预作用的研究,R459.7
  14. 高剂量维生素C杀死肾癌细胞相关机理研究,R737.11
  15. PARP-1活性参与NF-κB的基因转录调控的机制研究,R363
  16. Toll样受体2的表达及其介导的胃癌侵袭能力的实验研究,R735.2
  17. 低氧对高原鼠兔和根田鼠部分血液指标的影响,Q494
  18. 低氧训练对VEGF基因不同基因型携带者急性高原反应的影响,G804.2
  19. 家蚕细胞色素P450的基因表达调控研究,S881.2
  20. 手性有机磷农药对映体间联合毒性作用研究,X174
  21. 两种酚类有机物臭氧氧化及其急性毒性研究,X703

中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产基础科学 > 水产生物学 > 水产动物学
© 2012 www.xueweilunwen.com