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壳聚糖对团头鲂吞噬细胞功能的调节及其作用机理研究

作　者: 郗明君
导　师: 刘小玲
学　校: 华中农业大学
专　业: 水产养殖
关键词: 团头鲂头肾吞噬细胞壳寡糖水溶性壳聚糖普通壳聚糖
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

本研究在对团头鲂头肾结构的观察,头肾吞噬细胞的分离、形态学及功能鉴定的基础上,主要研究了三种不同分子量不同水溶性壳聚糖对吞噬细胞吞噬功能及呼吸爆发功能的影响,同时通过添加不同配体直接作用于细胞上初步探讨了三种壳聚糖与分离纯化吞噬细胞的结合能力及其对吞噬细胞功能影响的作用机理。主要为继续深入研究壳聚糖对团头鲂吞噬细胞功能调节的作用机理打下基础。主要结果如下：(1)对团头鲂头肾的解剖结构,显微结构,超显微结构进行了分析。结果显示,团头鲂头肾位于胸腔内咽退缩肌上方两侧,分左右两叶,组织切片观察头肾完全属于网状淋巴组织,分为淋巴细胞聚集区和粒细胞聚集区并且两聚集区是连续的。印迹片及超薄切片均可以鉴定头肾中的免疫细胞。其中粒细胞中含有其他细胞缺少的特殊颗粒,巨噬细胞有伪足,胞质内有溶酶体,淋巴细胞含有较大的核。(2)对团头鲂头肾吞噬细胞的显微、超显微结构观察及其贴壁纯化培养的显微结构进行观察与分析,结果显示巨噬细胞表面形成粗大的伪足,胞质含有大量溶酶体、空泡以及线粒体、内质网。溶酶体电子密度不一,大小不等。粒细胞内含有大量大小不等的特殊颗粒。特殊颗粒为具有棒针状电子致密核心的圆形或椭圆形的颗粒或为具有圆形电子致密核心的圆形或椭圆形颗粒,淋巴细胞细胞核几乎占据整个细胞。分离吞噬细胞培养3h时,淋巴细胞和未贴壁的吞噬细胞含量很少,贴壁吞噬细胞多呈圆形。平铺在培养皿底部,呈煎鸡蛋状,细胞核偏向细胞一侧。培养18h后Hanks液洗去未贴壁及死细胞后贴壁吞噬细胞铺展或伸长呈各种形状在培养皿底部,并且发现贴壁细胞有扎堆生长的特性。一般5-6个生长在一起。(3)对分离吞噬细胞的吞噬功能与呼吸爆发功能的检测与分析,结果显示,刚分离的和培养3h的细胞都具有较强的吞噬福尔马林灭活的金黄色葡萄球菌的能力,其中刚分离的吞噬细胞的吞噬百分比为25.50%±0.58%,吞噬指数为90.80±0.84。电镜下可观察到两种细胞具有吞噬能力,分别为巨噬细胞和中性粒细胞,巨噬细胞中有大小不等的吞噬泡,有些吞噬泡内的细菌已开始变形降解。在吞噬泡周围有较多溶酶体靠近,还可观察到溶酶体融合进入吞噬泡。中性粒细胞中同样也还有大小不等的吞噬泡。在对团头鲂头肾吞噬细胞呼吸爆发活性的研究中,发现空白对照组中,发荧光的细胞比例只有4.64%,荧光强度为111.07。而在实验组中佛波豆蔻酸乙酯(PMA)刺激后发荧光的细胞比例为79.88%,荧光强度为459.42。无论在发荧光细胞比例还是细胞的总体荧光强度都呈极显著性差异(P<0.01)。(4)对三种不同壳聚糖对分离吞噬细胞吞噬功能及呼吸爆发功能影响的检测与分析。结果显示,三种壳聚糖组(100μg/mL)均能显著提高吞噬细胞的吞噬活性(P<0.01),添加壳聚糖组,吞噬细胞吞噬能力显著增加,细胞内吞噬大量的金黄色葡萄球菌,并且细胞发生变形,而对照组吞噬的金黄色葡萄球菌相对较少。三种壳聚糖组间无差异(P>0.05)。三种壳聚糖组在发荧光细胞百分比及细胞发荧光强度上均极显著高于对照组(P<0.01)。其中水溶性壳聚糖组的发荧光细胞百分比显著高于其他实验组,而在细胞发荧光强度上,普通壳聚糖作用相对较高。(5)竞争抑制实验结果显示荧光显微镜下观察三种壳聚糖对M-FITC-BSA与吞噬细胞的结合均有抑制作用。荧光显微镜下发现对吞噬细胞呼吸爆发的刺激,壳寡糖+甘露糖组,水溶性壳聚糖+甘露糖组,普通壳聚糖+甘露糖组荧光强度及发荧光细胞数与各自的阳性对照组相比均有减少,而壳寡糖+半乳糖组,水溶性壳聚糖+半乳糖组,普通壳聚糖+半乳糖组与各自的阳性对照组无明显变化。

全文目录

摘要  8-10
Abstract  10-12
缩略语表  12-13
第一章文献综述  13-23
  1 壳聚糖研究进展  13-15
    1.1 免疫增强剂在水产养殖上的应用现状  13-14
    1.2 壳聚糖概述  14-15
      1.2.1 壳聚糖的结构特性  14-15
      1.2.2 壳聚糖的应用  15
  2 壳聚糖的免疫调节作用  15-21
    2.1 鱼类头肾及头肾吞噬细胞概述  16-18
      2.1.1 鱼类头肾概述  16
      2.1.2 鱼类头肾免疫细胞  16-18
        2.1.2.1 淋巴细胞  16-17
        2.1.2.2 吞噬细胞  17-18
    2.2 壳聚糖免疫调节的作用机理  18-20
      2.2.1 壳聚糖对巨噬细胞信号通路的激活作用及细胞因子分泌的影响  19-20
      2.2.2 壳聚糖弱化激活状态巨噬细胞的作用  20
    2.3 壳聚糖对鱼类免疫机能影响的研究进展  20-21
  3 研究目的与意义  21-23
第二章团头鲂头肾的形态结构  23-30
  1 材料与方法  23-24
    1.1 实验材料  23
    1.2 试剂的配制  23-24
    1.3 实验方法  24
      1.3.1 团头鲂头肾的解剖结构  24
      1.3.2 团头鲂头肾的显微结构  24
      1.3.3 团头鲂头肾的超显微结构  24
  2 实验结果  24-28
    2.1 团头鲂头肾的解剖结构  24-25
    2.2 团头鲂头肾的显微结构  25-27
    2.3 团头鲂头肾的超显微结构  27-28
  3 讨论  28-30
第三章团头鲂头肾吞噬细胞的分离  30-36
  1 材料与方法  30-32
    1.1 实验材料  30
    1.2 试剂的配制  30-31
    1.3 实验方法  31-32
      1.3.1 头肾单细胞悬液的制备  31
      1.3.2 头肾吞噬细胞的分离  31
      1.3.3 分离吞噬细胞超显微结构的观察  31
      1.3.4 头肾吞噬细胞的贴壁培养  31-32
  2 实验结果  32-35
    2.1 头肾单细胞悬液细胞类型  32
    2.2 分离吞噬细胞类型及其显微超显微结构的观察  32-33
    2.3 贴壁吞噬细胞的组成及形态  33-35
  3 讨论  35-36
第四章团头鲂头肾吞噬细胞功能的检测  36-43
  1 材料与方法  36-38
    1.1 实验材料  36
    1.2 实验方法  36-38
      1.2.1 吞噬原的制备  36-37
      1.2.2 头肾吞噬细胞吞噬活性的测定  37
      1.2.3 头肾吞噬细胞吞噬作用的超微结构观察  37
      1.2.4 头肾吞噬细胞呼吸爆发的测定  37-38
        1.2.4.1 荧光显微镜法观察贴壁吞噬细胞的呼吸爆发  37
        1.2.4.2 流式细胞术  37-38
    1.3 统计分析  38
  2 实验结果  38-41
    2.1 团头鲂头肾吞噬细胞吞噬活性的测定  38-39
    2.2 团头鲂头肾呼吸爆发功能的测定  39-41
      2.2.1 荧光显微镜法观察贴壁吞噬细胞的呼吸爆发  39-40
      2.2.2 流式细胞术法  40-41
  3 讨论  41-43
第五章壳聚糖对团头鲂头肾吞噬细胞功能影响的测定  43-51
  1 材料与方法  43-45
    1.1 实验材料  43-44
    1.2 实验方法  44
      1.2.1 壳聚糖对头肾吞噬细胞吞噬功能的影响  44
      1.2.2 壳聚糖对头肾吞噬细胞呼吸爆发功能的影响  44
    1.3 统计分析  44-45
  2 实验结果  45-48
    2.1 壳聚糖对团头鲂头肾吞噬细胞吞噬功能的影响  45-46
    2.2 壳聚糖对团头鲂头肾吞噬细胞呼吸爆发功能的影响  46-48
  3 讨论  48-51
    3.1 壳聚糖对体外分离团头鲂头肾吞噬细胞吞噬功能的影响  48-49
    3.2 壳聚糖对体外分离团头鲂头肾吞噬细胞呼吸爆发功能的影响  49-51
第六章壳聚糖调节吞噬细胞功能的作用机理的初步分析  51-61
  1 材料与方法  52-53
    1.1 实验材料  52
    1.2 实验方法  52-53
      1.2.1 激光扫描共聚焦显微镜观察团头鲂吞噬细胞与M-FITC-BSA的结合  52
      1.2.2 荧光显微镜分析甘露糖,半乳糖,壳寡糖,水溶性壳聚糖,普通壳聚糖对M-FITC-BSA与吞噬细胞结合的影响  52-53
      1.2.3 荧光显微镜分析甘露糖,半乳糖分别对壳寡糖,水溶性壳聚糖,普通壳聚糖刺激吞噬细胞产生呼吸爆发的影响  53
  2 结果  53-59
    2.1 激光扫描共聚焦显微镜观察团头鲂头肾吞噬细胞与M-FITC-BSA的结合  53-55
    2.2 荧光显微镜分析甘露糖,半乳糖,壳寡糖,水溶性壳聚糖,普通壳聚糖对M-FITC-BSA与吞噬细胞结合的影响  55-56
    2.3 荧光显微镜分析甘露糖,半乳糖分别对壳寡糖,水溶性壳聚糖,普通壳聚糖刺激吞噬细胞产生呼吸爆发的影响  56-59
  3 讨论  59-61
参考文献  61-71
硕士期间发表的论文  71-72
致谢  72

壳聚糖对团头鲂吞噬细胞功能的调节及其作用机理研究

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