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羊肺炎支原体内蒙古分离株的同源性研究及双重PCR检测方法的建立

作　者: 张明月
导　师: 吴树清
学　校: 内蒙古农业大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 绵羊肺炎支原体羊传染性胸膜肺炎同源性分析双重PCR检测
分类号: S858.26
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

羊传染性胸膜肺炎,是由多种致病支原体引起山羊和绵羊的一种高度接触性的传染病,该病已成为严重危害我区养羊业健康发展的主要传染病之一。本实验从内蒙古自治区不同地区疑似支原体肺炎发病羊及病死羊样本中分离培养支原体,经形态观察、生化试验和分子生物学方法确定由绵羊和山羊体内分离到的两株支原体均为绵羊肺炎支原体,证实绵羊肺炎支原体既能感染绵羊也可感染山羊。通过提取支原体DNA,扩增、克隆、测定16SrRNA部分序列,与绵羊肺炎支原体国际标准株Y-98进行比对,分析发现两株菌与模式株的同源性均在99.8%以上。而通过RAPD技术比对了分离株与模式株在基因组上的差异,发现以同一种方法制备DNA模板在同一引物、相同条件下,分离株与模式株扩增出的条带大小有明显差异,说明地方分离株可能存在一定变异。为今后选取地方代表株进行疫苗和药物研制奠定了基础。实验还根据丝状支原体山羊亚种(Mycoplasma mycoide subsp.capri, Mmc)和绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae, MO)两类病原的16SrRNA保守核酸序列设计了两对特异性引物,建立的双重PCR检测方法可以对这两类病原同时做出准确鉴别诊断,并用此法对临床样本进行检测。结果显示：该方法具有良好的特异性,MO模式株Y-98和MMC标准株PG3分别扩增出与预期结果相符的200bp和400bp片段,2株实验室分离支原体与Y-98扩增结果一致,诊断为绵羊肺炎支原体,与生化和血清学鉴定结果相符；该方法检测精氨酸支原体(Mycoplasma arginini)、解脲支原体(Mycoplasma urealytium; Uu)、猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)、羊链球菌(Caprine chain coccus)、葡萄球菌(Staphylococci)、多杀巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、大肠杆菌O78(Escherichia coli)等参考菌株均呈扩增阴性,说明该检测体系设计的引物特异性高。该方法能分别检测出5pg/μL的MMC DNA和0.5pg/μL的MO DNA,或同时检测出5pgMMC/μL和1pg/μLMO混合的DNA,说明具有很好的敏感性。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-8
1 前言  8-16
  1.1 羊支原体性肺炎概述  8-9
  1.2 研究背景与意义  9
  1.3 支原体的国内外研究现状  9-16
    1.3.1 支原体的发现  9-10
    1.3.2 肺炎支原体分类学地位  10-11
    1.3.3 支原体生理特性  11-12
    1.3.4 肺炎支原体免疫学研究  12
    1.3.5 支原体的致病性研究  12-13
    1.3.6 RAPD技术与支原体多样性  13-14
    1.3.7 羊肺炎支原体检测方法的研究  14-16
2 实验研究  16-42
  2.1 实验一病原的分离鉴定和亲源性分析  16-30
    2.1.1 材料  16-17
    2.1.2 实验方法  17-25
    2.1.3 结果与分析  25-30
    2.1.4 讨论  30
  2.2 实验二内蒙古地区绵羊肺炎支原体的基因多态性分析  30-34
    2.2.1 实验材料  30
    2.2.2 实验方法  30-31
    2.2.3 结果与分析  31-33
    2.2.4 讨论  33-34
  2.3 实验三羊肺炎支原体病原双重PCR鉴别检测方法的研究  34-42
    2.3.1 材料和方法  34-37
    2.3.2 结果与分析  37-41
    2.3.3 讨论  41-42
3 总体讨论  42-43
4 总体结论  43-44
致谢  44-45
参考文献  45-50
作者简介  50

羊肺炎支原体内蒙古分离株的同源性研究及双重PCR检测方法的建立

内容摘要

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