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富马酸基因工程菌的构建

作　者: 吴世根
导　师: 王芳
学　校: 北京化工大学
专　业: 化学工程与技术
关键词: 富马酸 草酰乙酸 丙酮酸羧化酶 富马酸酶 乳酸脱氢酶
分类号: TQ921
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


富马酸是一种重要的化工原料和精细化工产品,在医药、化工、树脂等领域有着非常广泛的应用前景,其生物生产方法已经受到了广泛的重视,如微生物发酵法。本文以毕赤酵母作为出发菌株,研究考察米根霉富马酸酶基因、毕赤酵母丙酮酸羧化酶基因在毕赤酵母细胞中的过表达对富马酸胞质途径的影响,以及敲除副产物乳酸代谢过程中的关键酶乳酸脱氢酶基因,使得更多碳源流向富马酸胞质途径。本实验克隆了毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)中编码丙酮酸羧化酶的基因(PC),在毕赤酵母中进行了强化表达,以研究PC基因在毕赤酵母中的过量表达对TCA还原途径碳源分流及草酰乙酸、L-苹果酸生产的影响。为此,研究构建了表达载体pPIC3.5K-PC,并转化了毕赤酵母GS115。转化子经过表型鉴定,PCR分析和G418浓度梯度筛选获得了高拷贝的重组子(pas-01)。甲醇诱导表达后,经SDS-PAGE分析及PC活性检测,发现酶活提高了3倍,说明PC在毕赤酵母中获得了成功表达。以pPIC3.5K转化菌为对照,对该重组子进行了草酰乙酸、苹果酸的发酵研究,结果显示草酰乙酸产量(177.4 mg.L-1)提高了109.6%,L-苹果酸的产量(127.45 mg.L-1)提高33.7%,菌体生物量提高15.7%,表明PC的过量表达有助于L-苹果酸、草酰乙酸的积累,并且对菌体的生长有一定的促进作用。为克隆米根霉细胞中的富马酸酶基因,本实验先后更换了二十对引物,尝试通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增富马酸酶基因片段,未果。随后根据米根霉富马酸酶基因的保守序列设计引物,扩增得到250bp长度的保守序列,与模板相比同源性只有76%；说明目前所使用的这株米根霉3.2686细胞中的富马酸酶基因序列与1959年以色列学者报导的模板序列具有较大差异,该菌中的fumR是一个新的基因。克隆了毕赤酵母中编码乳酸脱氢酶的基因LDH,同时也克隆了博来霉素抗性基因zeocin,构建了LDH敲除载体pMD18-T-LDHup-Zeocin-LDHdown,其中上游同源臂有900bp左右,下游同源臂包含500bp大小的序列,通过同源重组敲除LDH基因。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-14
第一章 文献综述  14-26
  1.1 富马酸的概况  14-16
    1.1.1 富马酸的理化性质  14
    1.1.2 富马酸的用途  14-15
    1.1.3 富马酸的生产方法  15-16
  1.2 草酰乙酸及苹果酸的概况  16-17
    1.2.1 草酰乙酸的概况  16-17
    1.2.2 苹果酸的概况  17
  1.3 富马酸的代谢分析  17-21
    1.3.1 富马酸的代谢网络  17-18
    1.3.2 富马酸的代谢分析  18-19
    1.3.3 富马酸代谢路径中的关键酶  19-20
      1.3.3.1 丙酮酸羧化酶(PC)  19
      1.3.3.2 富马酸酶(FUM)  19-20
    1.3.4 乳酸脱氢酶(LDH)  20-21
  1.4 毕赤酵母表达系统  21-22
    1.4.1 毕赤酵母的生物学特性  21
    1.4.2 毕赤酵母的载体  21
    1.4.3 毕赤酵母宿主菌  21-22
  1.5 富马酸基因工程菌的研究  22-23
    1.5.1 富马酸基因工程菌构建的相关研究进展  22
    1.5.2 丙酮酸羧化酶的研究进展  22-23
  1.6 研究计划部分  23-26
    1.6.1 课题的创新之处  23
    1.6.2 课题的构建思路  23-24
    1.6.3 论文选题的立论、目的和意义  24
    1.6.4 课题的主要研究内容  24-26
第二章 米根霉富马酸酶基因的克隆  26-42
  2.1 引言  26
  2.2 材料与方法  26-35
    2.2.1 菌株与质粒  26
    2.2.2 实验试剂及实验设备  26-27
    2.2.3 培养基  27
    2.2.4 实验方法  27-35
      2.2.4.1 RNA提取前的准备工作  27
      2.2.4.2 试剂盒Trizol法提取总RNA  27
      2.2.4.3 改进的Trizol法提取总RNA  27-28
      2.2.4.4 热苯酚法提取总RNA  28
      2.2.4.5 琼脂糖凝胶电泳检测总RNA  28-29
      2.2.4.6 总RNA纯度和完整性及产量的测定  29
      2.2.4.7 两步法逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增目的基因fumR  29-30
      2.2.4.8 琼脂糖凝胶电泳回收fumR DNA片段  30-31
      2.2.4.9 目的基因fumR与T载体的连接  31
      2.2.4.10 大肠杆菌DH5α化学转化法感受态细胞的制备  31-32
      2.2.4.11 fumR-pMD18-T重组载体的化学转化  32
      2.2.4.12 fumR-pMD18-T重组子阳性克隆的筛选  32-33
      2.2.4.13 PCR产物的序列分析  33
      2.2.4.14 巢式PCR扩增fumR基因片段  33-34
      2.2.4.15 RT-PCR扩增fumR片段中的保守区域  34-35
  2.3 结果与讨论  35-40
    2.3.1 米根霉(Rhizopus oryzae CGMCC 3.2686)总RNA的提取  35-36
    2.3.2 总RNA纯度和产量的测定  36
    2.3.3 RT-PCR扩增fumR  36
    2.3.4 T载体重组子的鉴定  36-38
    2.3.5 米根霉基因组的提取  38
    2.3.6 以米根霉基因组为模板扩增fumR序列  38-39
    2.3.7 fumR保守区域的扩增  39-40
  2.4 小结  40-42
第三章 丙酮酸羧化酶基因在毕赤酵母中的过量表达  42-70
  3.1 引言  42
  3.2 材料与方法  42-51
    3.2.1 菌株与质粒  42
    3.2.2 实验试剂和仪器设备  42
    3.2.3 培养基与培养条件  42-43
    3.2.4 实验方法  43-51
      3.2.4.1 毕赤酵母GS115基因组的提取  43-44
      3.2.4.2 聚合酶链式反应(PCR)扩增丙酮酸羧化酶基因PC  44-45
      3.2.4.3 PC基因与pMD18-T载体的连接  45
      3.2.4.4 重组DNA的电转化  45-46
      3.2.4.5 阳性克隆的筛选  46-47
      3.2.4.6 PC基因的测序分析  47
      3.2.4.7 重组表达质粒pPIC3.5K-PC的构建  47-48
      3.2.4.8 重组质粒pPIC3.5K-PC的鉴定  48
      3.2.4.9 毕赤酵母感受态度制备(电转化)  48-49
      3.2.4.10 His~+Mut~+重组子的筛选  49
      3.2.4.11 毕赤酵母重组子的PCR鉴定  49
      3.2.4.12 毕赤酵母中甲醇诱导表达丙酮酸羧化酶  49-50
      3.2.4.13 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白浓度的测定  50
      3.2.4.14 丙酮酸羧化酶酶活的测定  50-51
      3.2.4.15 重组菌的生长情况  51
  3.3 结果与讨论  51-67
    3.3.1 毕赤酵母基因组提取  51-52
    3.3.2 PCR扩增丙酮酸羧化酶基因PC  52-54
      3.3.2.1 PC克隆的阳性重组子的菌落PCR验证  52-53
      3.3.2.2 T载体重组质粒的酶切验证  53-54
    3.3.3 PC基因的序列分析  54
    3.3.4 重组表达质粒pPIC3.5K-PC的构建  54-57
      3.3.4.1 pPIC3.5K-PC重组子的菌落PCR鉴定  54
      3.3.4.2 pPIC3.5K-PC的酶切鉴定  54-56
      3.3.4.3 pPIC3.5K-PC测序分析  56-57
    3.3.5 pPIC3.5K-PC毕赤酵母重组子His~+Mut~+表型的筛选  57-58
      3.3.5.1 His~+表型重组子的筛选  57
      3.3.5.2 His~+Mut~+表型毕赤酵母重组子的筛选  57-58
    3.3.6 His~+Mut~+表型重组子的PCR分析鉴定  58-59
    3.3.7 重组丙酮酸羧化酶的诱导表达  59-61
      3.3.7.1 蛋白浓度标准曲线的绘制  59-60
      3.3.7.2 目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间的确定  60
      3.3.7.3 重组蛋白的诱导表达  60-61
    3.3.8 重组丙酮酸羧化酶的酶活测定  61-62
    3.3.9 重组菌的生长曲线  62
    3.3.10 标准曲线的绘制  62-66
      3.3.10.1 富马酸标准曲线的绘制  62-63
      3.3.10.2 草酰乙酸的标准曲线的绘制  63-64
      3.3.10.3 L-苹果酸标准曲线的绘制  64-65
      3.3.10.4 乙醇标准曲线的绘制  65-66
    3.3.11 富马酸、苹果酸、草酰乙酸发酵生产  66-67
  3.4 小结  67-70
第四章 乳酸脱氢酶基因LDH敲除载体的构建  70-78
  4.1 引言  70
  4.2 材料与方法  70-72
    4.2.1 菌株与质粒  70
    4.2.2 实验试剂和仪器设备  70
    4.2.3 培养基  70-71
    4.2.4 实验方法  71-72
      4.2.4.1 毕赤酵母GS115基因组的提取  71
      4.2.4.2 毕赤酵母GS115乳酸脱氢酶基因LDH的克隆  71-72
      4.2.4.3 PCR扩增博来霉素基因(Zeocin)  72
      4.2.4.4 敲除载体pMD18-T-LDHup-Zeocin-LDHdown载体的构建  72
  4.3 实验结果与讨论  72-76
    4.3.1 LDH乳酸脱氢酶基因的克隆  72-74
    4.3.2 PCR扩增zeocin编码基因  74
    4.3.3 zeocin编码基因的克隆  74-75
      4.3.3.1 菌落PCR的分析  74-75
      4.3.3.2 酶切鉴定重组质粒pMD18-T-zeocin  75
    4.3.4 敲除质粒pMD18-T-LDH-up-zeocin-down-LDH的构建  75-76
  4.4 小结  76-78
第五章 实验总结与建议  78-80
  5.1 主要结论  78
  5.2 建议  78-80
参考文献  80-84
附录  84-88
致谢  88-90
研究成果及发表的学术论文  90-92
作者和导师简介  92-93
附件  93-94

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 发酵法制有机酸
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