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蜱唾液腺蛋白Salp20的补体抑制机制和卵黄发生的激素调控

作　者: 杨晓红
导　师: 刘敬泽
学　校: 河北师范大学
专　业: 生态学
关键词: 肩突硬蜱伽氏疏螺旋体补体替代途径 C3转化酶 P因子长角血蜱卵黄发生
分类号: S852.746
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

蜱类是世界广泛分布的专性吸血外寄生物，由其传播的人畜疾病非常多，对人类及畜牧业发展危害极大。肩突硬蜱（Ixodes scapularis），又名鹿蜱、黑腿壁虱，可传播多种病原体，包括莱姆病病原体伯格多弗疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）。肩突硬蜱唾液腺分泌多种具有抗炎症反应、抗凝血和抗免疫反应的唾液分子到宿主体内，抑制宿主对蜱体表吸血的抵御反应。该蜱唾液腺蛋白Salp20能保护莱姆病血清敏感型病原体伽氏疏螺旋体（B. garinii）免受补体介导的裂解。本文表达纯化了蜱唾液腺蛋白Salp20，对其分离纯化条件进行了优化，并对其补体抑制机制进行了研究。该研究对蜱媒疾病防治和畜牧业发展具有重要的理论和实际应用意义。优化后的分离条件为：500ml样品量流经500μl的Ni-NTA亲和层析柱，用2ml含有20mM咪唑的缓冲液清洗四次，用250μl含有500mM咪唑的洗脱液洗脱四次并收集样品。SDS-PAGE和Western blot分析所得蛋白样品，结果显示蛋白具有高纯度且为目的蛋白Salp20。纯化的Salp20能够保护伽氏疏螺旋体免受补体裂解，证明分离纯化所得蛋白具有很高的生物学活性。用C3b单克隆抗体检测莱姆病病原体表面C3b的沉积，免疫荧光分析结果显示血清敏感型病原体伽氏疏螺旋体表面有大量的C3b沉积，而血清抗型伯格多弗疏螺旋体表面C3b沉积量极少。说明血清敏感型病原体伽氏疏螺旋体能够引发强烈的补体反应，而血清抗型伯格多弗疏螺旋体不能。用C3b和P因子单克隆抗体检测伽氏疏螺旋体表面补体替代途径中C3b和P因子的沉积，免疫荧光分析结果显示菌体表面有大量的C3b和P因子沉积，说明伽氏疏螺旋体引发了强烈的补体替代途径反应。向反应体系加入10μg/ml Salp20后，菌体表面没有C3b和P因子沉积，说明Salp20可抑制补体替代途径中的C3b和P因子结合到伽氏疏螺旋体表面。伽氏疏螺旋体与10μg/ml P因子反应后，菌体表面无P因子的沉积。伽氏疏螺旋体与C3缺失型人血清反应后，发现菌体表面无P因子。表明P因子不能直接与伽氏疏螺旋体表面结合来起始补体替代途径。因此Salp20通过P因子结合，使其不能稳定C3转化酶，抑制了C3b蛋白的产生，从而抑制了补体替代途径。研究了两种激素20-羟基蜕皮酮（20-hydroxyecdysone，20E）和保幼激素III（juvenile hormone III，JH III）对长角血蜱（Haemaphysalis longicornis）孤雌生殖种群卵黄发生的影响，对揭示蜱类生殖生物学规律和蜱类防治具有重要的科学意义。蜱在宿主体表吸血3天后，向半饱血成蜱注射20E和JH III，20E的最大注射剂量为10μg/tick，JH III的最大注射剂量为5μg/tick。注射后三天检测结果。体式显微镜下观察20E注射剂量为0.5μg/tick和1μg/tick20E蜱的卵巢充满了含有卵黄颗粒的卵细胞，卵巢体积较大，整体呈现棕黄色，而注射对照组卵巢体积极小，呈白色半透明状。这两个注射剂量组蜱的卵巢重量占体重比例，脂肪体、血淋巴和卵巢中卵黄原蛋白白含量和卵黄原蛋白含量与对照组相比较显著增高。注射JH III蜱的的卵巢重量占体重比例，脂肪体、血淋巴和卵巢中卵黄原蛋白白含量和卵黄原蛋白含量与对照组相比较无显著差异。说明20E对半饱血期孤雌生殖长角血蜱卵黄发生和卵黄原蛋白的摄取具有促进作用，而JH III无作用。向饱血当天成蜱注射20E和JH III，20E的最大注射剂量为1μg/tick，JH III的最大注射剂量为0.5μg/g bw。注射后四天检测结果。结果显示20E和JH III注射组蜱卵巢重量，脂肪体、血淋巴、卵巢组织中卵黄原蛋白和Vn含量与对照组无显著差异。说明这两种激素对饱血期长角血蜱卵黄发生无作用。这些结果表明20E对半饱血蜱卵黄发生具有促进作用，但对饱血期蜱卵黄发生无显著作用。JH III对半饱血期和饱血期蜱的卵黄发生均无显著影响。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-10
第一章研究背景及意义  10-21
  1 蜱类介绍  10-11
  2 寄主对蜱类吸血的反应  11
  3 蜱唾液中的功能分子  11-17
    3.1 抗凝血成分  11-13
    3.2 抗炎症反应成分  13-14
    3.3 免疫抑制分子  14-17
  4 宿主补体途径  17-18
    4.1 经典途径  17
    4.2 凝集素激活途径  17-18
    4.3 替代途径  18
  5 替代途径调节因子  18-19
  6 抗补体唾液腺蛋白  19-21
第二章 Salp20 的表达及纯化  21-30
  1 方法和材料  21-24
    1.1 细胞和培养基  21-22
    1.2 重组细胞的培养  22
    1.3 分离纯化蛋白  22-23
    1.4 蛋白纯度及浓度测定  23
    1.5 Western blot  23
    1.6 Salp20 蛋白生物活性测定  23-24
  2 结果  24-28
    2.1 SDS-PAGE 和 Western blot 分析结果  24-25
    2.2 纯化各批次蛋白纯度和浓度测定结果  25-27
    2.3 蛋白活性测定结果  27
    2.4 优化的分离纯化方法  27-28
  3 讨论  28-30
第三章 Salp20 的补体抑制机制研究  30-42
  1 方法和材料  31-33
    1.1 莱姆病病原体极其培养条件  31
    1.2 主要试剂  31
    1.3 病原体表面补体反应的测定  31-32
    1.4 Salp20 对病原体表面补体蛋白 C3 和 P 因子的影响  32
    1.5 补体替代途径起始机制研究  32-33
  2 结果  33-38
    2.1 两种莱姆病病病原体表面补体反应的测定  33
    2.2 Salp20 对补体替代途径的影响  33-37
    2.3 补体替代途径起始机制研究  37-38
  3 讨论  38-42
第四章长角血蜱孤雌生殖种群卵黄发生的激素调控  42-57
  1 20E 和 JH III 对吸血初期长角血蜱孤雌生殖种群卵黄发生的影响  42-51
    1.1 材料方法  42-44
    1.2 结果  44-51
  2 20E 和 JH III 对饱血期长角血蜱孤雌生殖种群卵黄发生的影响  51-55
    2.1 材料方法  51
    2.2 结果  51-55
  3 讨论  55-57
第五章总结  57-58
参考文献  58-73
致谢  73-74
科研项目及成果  74-75
  1 参加的科研项目  74
  2 取得的科研成果  74-75
    2.1 发表论文  74-75
    2.2 参编著作  75

蜱唾液腺蛋白Salp20的补体抑制机制和卵黄发生的激素调控

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