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利用发酵技术生产APP菌影疫苗的研究

作　者: 魏延宏
导　师: 宋桂敏; 金天明
学　校: 天津农学院
专　业: 预防兽医学
关键词: App 菌影疫苗检测培养基发酵
分类号: S852.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 34次
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内容摘要

胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）是引起猪传染性胸膜肺炎的病原菌，该病是一种高度接触性呼吸道传染病，是危害养猪业的主要呼吸道传染病之一。由于APP的血清型较多，且各血清型间的交叉保护力不强，因此，传统的灭活苗和弱毒苗对猪传染性胸膜肺炎的防治效果不佳。免疫原性高兼具佐剂功能的菌影疫苗的出现为猪传染性胸膜肺炎的防治提供了新思路。目前，国内对于菌影的研究多局限于实验室阶段，其特点是实验精准度高、菌影产量低、生产成本高。本课题的研究目的是探寻一种提高菌影疫苗产量、降低生产成本，并使之产业化和规模化发酵生产的新途径。本试验以pMC-WK APPⅠ为菌种，探索利用发酵技术生产APP菌影疫苗。pMC-WKAPPⅠ是以APPⅠ为宿主菌，将含有温控基因λpL/pR-cI857、裂解基因E和核酸酶A基因的质粒装载其中的重组菌。试验首先建立pMC-WK APPⅠ和菌影的检测方法，通过革兰氏染色镜检对pMC-WK APPⅠ进行初检，以DLS的特异性引物对pMC-WK APPⅠ质粒进行PCR扩增予以复检，尽管上述方法能检测菌种又能确定质粒的保有情况，但PCR无法对裂解后内容物流出的菌影进行检测，所以引入间接ELISA法，通过对菌体的外膜抗原的检测进而实现对APP菌影检测的目的。该方法可检测OD600nm≥0.4的菌液，检出率达84%以上。在进行发酵生产技术研究前，还需要对pMC-WK APPⅠ裂解形成菌影的条件作进一步的研究。实验中通过对裂解的最佳完成温度和最佳时机进行对比试验，最终确定的最佳制备体系为：在28℃培养pMC-WK APPⅠ，待OD600达到0.08~0.14后，升温至42℃诱导裂解1.5h，再次提高温度至47℃高温震荡2h。降低菌影疫苗生产成本的关键在于培养基，对胸膜肺炎放线杆菌pMC-WK APPⅠ高密度生产APP菌影疫苗培养基的主成分及其含量进行优化。通过单因素试验，获得发酵生产培养基中酵母粉、大豆蛋白胨和葡萄糖的含量对生产菌影有显著影响；运用响应面分析法，得出三元二次回归方程拟合的三种因素与菌影产量间的对应关系，即当酵母粉、大豆蛋白胨、葡萄糖三因素的浓度分别为10.86g/L、13.33g/L和2.58g/L时，APP菌影疫苗的产量可达到最佳值3.381，且成本降低至2.95元/g。通过对接种量、搅拌速度、溶氧量、pH值等发酵参数的反复试验，将发酵生产菌影的全过程确定为种子培养阶段、发酵生产阶段和菌影收获阶段组成。其中发酵阶段又分为批量生长阶段、诱导裂解阶段和高温完成阶段。批量生长阶段，以2%的接种量接种入发酵罐中，温度、搅拌速度、溶氧量和pH值分别设定为28℃、300rpm、20%和7.2。约2h后，OD600nm值达到0.1~0.15，将发酵罐温度提高至42℃，升温过程大约需要10min。随后进入诱导裂解阶段，42℃持续诱导90min后，无需添加其他物质。再次升温至47℃，高温完成阶段用时2h。经过SEM，裂解得到的菌影外形与原始菌基本一致，仅因内容物流出而变得皱缩。虽然经过47℃高温震荡处理，但SDS-PAGE分析结果显示，菌影疫苗的外膜蛋白成分与未经过高温处理的APPⅠ型菌株和42℃诱导裂解的菌株完全一致，并未受到高温破坏，保证了其表面抗原的完整性。同时，在动物免疫攻毒试验中，APP菌影疫苗对胸膜肺炎放线杆菌感染的保护率达到100%。

全文目录

摘要  12-14
Abstract  14-16
第一章引言  16-26
  1 菌影  16-17
  2 温控双基因裂解菌影  17-19
    2.1 裂解基因 E  17
    2.2 金黄色葡萄球菌核酸酶 A  17-18
    2.3 猪胸膜肺炎放线杆菌和 pMC-WK APPⅠ  18-19
  3 菌影的应用  19-23
    3.1 菌影单独作用  19-20
    3.2 菌影作为佐剂  20
    3.3 菌影作为外源蛋白的载体  20-21
    3.4 菌影作为生物活性物质的载体  21-22
    3.5 菌影作为 DNA 疫苗载体  22
    3.6 白色生物技术-菌影作为酶反应的微反应器  22-23
  4 以 E. coli 为宿主菌的菌影疫苗发酵技术  23-26
    4.1 大肠杆菌的菌影生产系统  23-25
    4.2 高密度流加式发酵生产重组 E.coli K-12 菌影疫苗  25-26
第二章 pMC-WK APP 发酵生产过程中菌影检测方法的建立  26-37
  1 材料和方法  26-32
    1.1 材料  26-28
    1.2 方法  28-32
  2 结果  32-35
    2.1 形态学鉴定  32
    2.2 PCR 检测  32-33
    2.3 间接 ELISA 检测  33-35
  3 讨论  35-36
  4 小结  36-37
第三章 pMC-WK APP 菌影裂解条件的优化  37-43
  1 材料和方法  37-40
    1.1 材料  37-38
    1.2 方法  38-40
  2 结果  40-42
    2.1 裂解完成温度的确定  40-41
    2.2 裂解时机的确定  41-42
  3 讨论  42
  4 小结  42-43
第四章 APP 菌影疫苗发酵培养基的优化  43-53
  1 材料与方法  43-44
    1.1 材料  43
    1.2 方法  43-44
  2 结果  44-51
    2.1 APP 菌影发酵培养基中碳源和氮源的确定  44-45
    2.2 利用响应面法优化发酵培养基的主成分  45-51
    2.3 最佳浓度的获取及验证实验  51
  3 讨论  51-52
  4 小结  52-53
第五章 APP 菌影疫苗的发酵工艺优化  53-57
  1 材料和方法  53-55
    1.1 材料  53-54
    1.2 方法  54-55
  2 结果  55-56
    2.1 发酵过程及参数  55
    2.2 Ca2+和 Mg2+对裂解效果的影响  55-56
  3 讨论  56
  4 小结  56-57
第六章发酵生产的菌影疫苗的评价  57-60
  1 材料和方法  57-58
    1.1 材料  57
    1.2 方法  57-58
  2 结果  58-59
    2.1 菌影生产对 APP 外膜蛋白的影响  58
    2.2 免疫攻毒试验  58-59
  3 讨论  59
  4 小结  59-60
结论  60-61
参考文献  61-66
附录  66-67
致谢  67-68
攻读硕士学位期间发表的论文  68

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