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微小隐孢子虫两个miRNA表达检测及真核表达载体的构建

作　者: 呼高伟
导　师: 程天印; 陈兆国
学　校: 湖南农业大学
专　业: 基础兽医
关键词: 微小隐孢子虫 microRNA real-time PCR 真核表达质粒 靶基因
分类号: S852.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


隐孢子虫病(cryptosporidiosis)是由原虫隐孢子虫(Cryptosporidium spp.)引起的一种人兽共患寄生虫病,临床上以自限性水样腹泻为主要症状。截止目前,临床上尚无特效的治疗药物和疫苗。同时,国内外也尚未见隐孢子虫microRNA (miRNA)发现和研究的报道。因此开展隐孢子虫的microRNA研究不仅有利于了解隐孢子虫的生长发育和调控机制,而且有助于发现新的药物作用靶标或设计新的疫苗,同时为有效防治该病提供新的途径。1、本实验室在前期工作中构建了微小隐孢子虫小RNA文库,并进行了序列测定和生物信息学分析,获得了微小隐孢子虫miRNA cp-miR-2980、 cp-miR-m0001的序列信息。本研究利用液氮研磨和Trizol试剂提取了6种/基因型隐孢子虫的总RNA,利用mirVanaTM miRNA Isolation Kit分离隐孢子虫的小RNA,用poly(A)聚合酶加尾后,再进行反转录,得到小RNA的cDNA模板。以微小隐孢子虫5S rRNA为内参,采用荧光定量PCR法检测cp-miR-2980、 cp-miR-m0001在Cryptosporidium andersoni、C. parvum、C. baileyi、 Cryptosporidium mouse genotype、C. cuniculus、C. suis6利,/基因型隐孢子虫卵囊中的表达情况。结果6种/基因型隐孢子虫卵囊均成功地检测出了cp-miR-2980、 cp-miR-m0001基因,但不同种/基因型隐孢子虫卵囊中的表达水平不同。本研究也同时证明荧光定量PCR是一种检测miRNA表达水平的简单、快速、敏感、特异、成本低的方法。2、从微小隐孢子虫(C. parvum)基因组DNA扩增cp-miR-2980、cp-miR-m0001前体,克隆到pMD18-T载体上,经测序鉴定正确后亚克隆到pVAX1载体上,转染HCT-8细胞,提取细胞总RNA, RT-PCR检测cp-miR-2980、cp-miR-m0001的表达。结果成功地构建了真核表达载体pVAX-cp-miR-2980、 pVAX-cp-miR-m0001, RT-PCR检测证实其均能在真核细胞HCT-8中表达,为后续研究cp-miR2980、cp-miR0001-5p的功能打下了基础。3、本实验室在前期工作中预测了微小隐孢子虫新的miRNA cp-miRm0001及其靶基因的序列信息,其中的一条靶基因为RAD50。本研究从微小隐孢子虫卵囊基因组DNA扩增到RAD50的3’非编译区(untranslation region, UTR)的部分序列,克隆到pMD18-T载体上,经测序鉴定正确后亚克隆到pGL3载体上,然后与pVAX-cp-m0001真核表达质粒共转染HCT-8细胞,同时共转染pRL-SV40质粒作为内对照,检测双荧光素酶活性。结果成功构建了含有440bp的RAD50基因3′UTR序列的荧光素酶报告基因重组质粒。将该重组质粒与pVAX-cp-miR-m0001一起共转染HCT-8细胞后,实验组的荧光素酶活性比值与对照组相比显著下降(P<0.05),说明cp-miR-m0001对RAD50的3’UTR荧光素酶报告基因载体的活性有抑制作用,这一抑制作用可能是由于cp-miR-m0001与RAD50的3′UTR的作用而产生的。本研究利用荧光定量PCR技术对6种/基因型隐孢子虫卵囊中cp-miR-2980、 cp-miR-m0001的表达情况进行了检测；构建了真核表达载体pVAX-cp-miR-2980、 pVAX-cp-miR0001并证实其能在真核细胞HCT-8中成功表达；成功构建了Cryptosporidium parvum Iowa Ⅱ RAD50的3′UTR荧光素酶报告基因载体,为进一步研究cp-miR-2980、cp-miR m0001的调控机制和功能提供了基础。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-11
第一章 文献综述  11-20
  1 隐孢子虫病的研究概况  11-13
    1.1 隐孢子虫病的危害性  11
    1.2 隐孢子虫生活史  11-12
    1.3 隐孢子虫病的预防和治疗  12-13
  2 microRNA及其研究进展  13-20
    2.1 miRNA的发现  13-14
    2.2 新miRNA的判断标准  14
    2.3 miRNA的结构特征和特点  14
    2.4 miRNA的合成和作用机制  14-15
    2.5 miRNA的分析方法  15
    2.6 miRNA的检测方法  15-18
    2.7 miRNA的应用  18-19
    2.8 存在的问题及研究展望  19-20
第二章 微小隐孢子虫miR-2980、miR-m0001在不同种型隐孢子虫卵囊中的表达水平  20-31
  1 材料与方法  20-21
    1.1 材料  20-21
  2 方法  21-25
    2.1 隐孢子虫卵囊的收集  21-22
    2.2 隐孢子虫卵囊的纯化  22
    2.3 隐孢子虫卵囊总RNA的提取  22-23
    2.4 分离和富集小RNA  23
    2.5 加poly(A)尾  23-24
    2.6 反转录合成cDNA  24
    2.7 cp-miR-2980、cp-miR-m0001表达水平的检测  24-25
    2.8 琼脂糖凝胶电泳  25
  3 结果  25-28
    3.1 小RNA的分离和鉴定  25
    3.2 Real-time PCR检测结果  25-28
  4 讨论  28-31
第三章 微小隐孢子虫miR-2980、miR-m0001的真核表达质粒的构建和初步鉴定  31-51
  1 材料和方法  31-32
    1.1 材料  31-32
  2 方法  32-42
    2.1 微小隐孢子虫microRNA的生物信息学分析  32
    2.2 微小隐孢子虫基因组DNA的提取  32-33
    2.3 cp-miR-2980前体、cp-miR-m0001前体引物的设计和合成  33
    2.4 PCR扩增目的序列  33-34
    2.5 琼脂糖凝胶电泳  34
    2.6 pMD-pre-cp-miR-2980、pMD-pre-cp-miR-m0001质粒的构建  34-37
    2.7 pVAX1-cp-miR-2980、pVAX1-cp-miR-m0001真核重组表达质粒的构建  37-39
    2.8 重组质粒pVAX1-cp-miR-2980、pVAX1-cp-miR-m0001和pVAX1质粒的纯化和去除内毒素处理  39-40
    2.9 转染HCT-8细胞  40-41
    2.10 重组质粒在HCT-8细胞中的表达检测和分析  41-42
  3 结果  42-49
    3.1 微小隐孢子虫microRNA二级结构的分析和预测  42-43
    3.2 对牛微小隐孢子虫microRNA的分析和预测  43-44
    3.3 cp-miR-2980前体、cp-miR-m0001前体片段的扩增  44-45
    3.4 重组质粒pMD-pre-cp-miR-2980和pMD-pre-cp-miR-m0001的酶切  45-46
    3.5 重组质粒pVAX-cp-miR-2980和pVAX-cp-miR-m0001的酶切  46
    3.6 重组质粒pVAX-cp-miR-2980和pVAX-cp-miR-m0001的序列测定结果  46-47
    3.7 HCT-8细胞总RNA提取  47-48
    3.8 RT-PCR检测结果  48-49
  4 讨论  49-51
第四章 微小隐孢子虫miR-m0001靶基因的初步验证  51-60
  1 材料和方法  51-52
    1.1 材料  51-52
  2 方法  52-56
    2.1 微小隐孢子虫基因组DNA的提取  52
    2.2 靶基因T引物的设计和合成  52
    2.3 PCR扩增目的序列  52
    2.4 琼脂糖凝胶电泳  52-53
    2.5 扩增目的片段与pMD18-T载体的连接  53
    2.6 pGL3 -T真核重组表达质粒的构建  53-54
    2.7 重组质粒pGL3-T、pGL3和pRL-SV40质粒的纯化和去除内毒素处理  54
    2.8 转染HCT-8细胞  54-55
    2.9 双荧光素酶活性检测  55-56
  3 结果  56-58
    3.1 靶基因的扩增  56
    3.2 重组质粒pMD-T的酶切鉴定  56-57
    3.3 重组质粒pGL3-T的酶切鉴定  57
    3.4 双荧光素酶报告基因检测与分析  57-58
  4 讨论  58-60
全文结论与创新  60-61
  1 全文结论  60
  2 创新点  60-61
参考文献  61-67
附录Ⅰ  67-68
附录Ⅱ  68-70
致谢  70-71
个人简介  71

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜寄生虫学
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