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IK细胞因子在牛植入前胚胎和牛胎儿成纤维细胞中的表达及作用

作　者: 刘冬
导　师: 刘东军
学　校: 内蒙古大学
专　业: 动物学
关键词: 细胞因子植入前胚胎发育组织相容性抗原母胎免疫耐受小干扰RNA 纺锤体组装检验点
分类号: S823
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

细胞因子IK(IKcytokine)是II类主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex, class Ⅱ, MHCII)下调因子,该基因编码的蛋白因含有多个精氨酸(arginine,R)、谷氨酸(glutamic acid,E)和天冬氨酸(aspartic acid, D)残基重复序列又名RED蛋白。MHCⅡ分子只在抗原提呈细胞(antigen-presenting cell, APC)中表达,如巨噬细胞、B细胞、已活化的T细胞、树突细胞等；在不表达MHCⅡ分子的非抗原提呈细胞中,多种细胞因子,如干扰素γ(interferony, IFNy)可诱导MHCⅡ分子的表达。细胞因子IK的功能就是抑制MHCⅡ分子在非抗原提呈细胞中的诱导性表达,对维持免疫系统稳定具有重要作用。本研究通过mRNA差异显示PCR方法(mRNA differential display reverse transcription polymerase chain reaction, mRNA DDRT-PCR)发现ik在牛植入前胚胎发育不同时期差异表达,实时定量PCR(quantitative real-timePCR,qPCR)结果显示在生发泡期卵母细胞(germinal vesicle, GV)、第二次减数分裂中期卵母细胞(second meiotic metaphase, Mil)和2细胞期胚胎中,ik表达量随发育阶段进展而下调；达到8细胞胚胎期,其表达量上调,并且达到植入前各发育阶段中表达量高峰；随后再次下调,到囊胚期时的表达水平低于MII期。据此确定细胞因子ik是一个牛植入前胚胎发育差异表达基因。用IK特异性抗体对体外受精合子、2细胞期、8细胞期胚胎、桑椹胚及囊胚的免疫荧光染色结果显示,IK在8细胞期前的发育阶段中无蛋白表达,从8细胞期开始在细胞核内有少量蛋白表达,至桑椹胚期各细胞核内均有IK蛋白表达,囊胚中滋养外胚层和内细胞团细胞核中均有其蛋白表达。对受精后Oh受精卵进行小干扰RNA(small interference RNA, siRNA)胞质显微注射干扰ik表达,并以注射等量发育液的胚胎为对照组,qPCR检测注射后24h的2细胞胚胎期干扰效率为79%(P<0.01)。统计干扰组与对照组胚胎发育率,发现细胞因子ik在受精卵期的下调可降低卵裂率和8细胞胚胎率(P<0.05),而对囊胚率则无显著影响(P>0.05)。进一步的qPCR显示,在注射后48h的8细胞胚胎期,ik表达量显著上升,且干扰组与正常发育组胚胎中的表达量无显著差异(P>0.05)；囊胚期干扰组胚胎中的ik表达量为正常发育组胚胎中表达量的0.74倍(P<0.01)。对ik干扰的2细胞期胚胎、8细胞期胚胎和囊胚进行免疫荧光染色,染色结果与正常发育胚胎无差别。这表明,在8细胞胚胎期发生的合子基因组激活(zygote genome activation,ZGA)活化了ik基因的转录,新合成的mRNA补充了卵母细胞的ikmRNA储备,对siRNA诱导的沉默进行了补偿；到囊胚期,ik转录减弱,siRNA的干扰效果得以显现。在8细胞期胚胎期前的发育阶段,胚胎中虽然有ik mRNA表达但并没有蛋白表达,然而在这期间干扰ikmRNA导致卵裂率和8细胞胚胎率降低,这表明在这期间可能有免疫荧光染色检测不到的少量IK蛋白表达,并且这少量的IK蛋白对卵裂和8细胞胚胎发育有重要作用。而在8细胞期胚胎中ikmRNA表达量达到高峰并开始有大量蛋白表达,说明ik在8细胞胚胎期有重要作用。由于这些大量表达的mRNA影响了之前siRNA的干扰作用而检测不到干扰效果,因此囊胚发育未受到影响。qPCR对ik下游基因牛Ⅱ类组织相容性复合物bola-drb3(Bos taurus major histocompatibility complex, class Ⅱ, DRB3)及Ⅱ类组织相容性复合物反式活化蛋白ciita (class Ⅱ, major histocompatibility complex, transactivator)的检测结果显示bola-drb3与ciita在GⅤ期、MⅡ期和2细胞胚胎中的mRNA表达量均维持较低水平,而在8细胞期均提高表达且达到峰值,在囊胚中mRNA表达量均降低至与8细胞胚胎前期的表达水平。对ik干扰组胚胎bola-drb3和ciita的qPCR结果显示在2细胞期、8细胞期胚胎和囊胚中,两基因的mRNA表达量均有降低。用CIITA特异性抗体对体外受精2细胞期、4细胞期、8细胞期胚胎、桑椹胚及囊胚和siRNA干扰ik表达的8细胞期胚胎、桑椹胚及囊胚的免疫荧光染色结果显示CIITA在植入前各阶段胚胎中均没有蛋白表达。说明干扰ik表达不会引起胚胎MHCⅡ表达失调。综上所述,在牛植入前胚胎中ik的表达受到严格的调控,不容易受到外源干扰RNA影响,对维持植入子宫时期MHCⅡ分子在胚泡表面不表达或低表达具有重要作用。用实时定量PCR检测细胞因子ik在牛胎儿成纤维细胞中的表达发现其丰度较高,而ciita和bola-drbi没有表达,同时有研究证明ik在Hela细胞中具有激活纺锤体组装检验点(spindle assembly checkpoint, SAC)的功能,因此为了确定细胞因子IK在牛胎儿成纤维细胞中的功能是否与SAC相关,本实验检测了ik过表达和干扰表达对SAC成员mad1、mad2及cdc20表达的影响。结果表明干扰ik表达并不影响SAC成员的mRNA表达水平,而过表达ik则会显著提高SAC关键组分mad2和cdc20的mRNA表达。推断ik对SAC的作用可能不是必要条件而是充分条件,即ik低表达不会抑制SAC功能,但其高表达可以促进SAC功能。本研究从牛胚胎发育和牛胎儿成纤维细胞两个方面检测细胞因子IK的功能,对研究细胞因子的作用提供了依据。

全文目录

摘要  4-8
ABSTRACT  8-12
缩略词表  12-16
序言  16-26
  1 胚胎着床的分子机制  16-18
    1.1 子宫上皮细胞表面黏附分子的作用  16-17
    1.2 酶与细胞因子的作用  17-18
  2 影响胚胎着床的因素  18-20
    2.1 胚胎发育缺陷  18
    2.2 母源性物质对体外受精胚胎发育的影响  18-20
  3 胚胎的半抗原性与子宫内膜容受性  20-23
    3.1 主要组织相容性抗原在胚胎植入子宫内膜过程中的作用  20-22
    3.2 细胞因子对胚胎发育的影响  22-23
  参考文献  23-26
第一章发育胚胎差异表达基因IK的筛选  26-41
  摘要  26-27
  1 材料与方法  27-32
    1.1 相关试剂及菌种  27-28
    1.2 卵母细胞的体外成熟  28
    1.3 体外成熟卵母细胞的体外受精与培养  28-29
    1.4 总RNA的提取与反转录  29
    1.5 差异显示PCR  29-30
    1.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳及差异DNA条带回收  30
    1.7 二次PCR产物的回收  30-31
    1.8 测序和数据库比对分析  31
    1.9 实时定量PCR  31-32
  2 结果  32-35
    2.1 体外发育胚胎收集  32-33
    2.2 差异转录基因的筛选  33-34
    2.3 差异条带序列分析  34
    2.4 差异转录基因在不同发育阶段中mRNA含量的定量检测  34-35
  3 讨论  35-38
    3.1 差异基因在8细胞期和囊胚期胚胎中的含量  35-37
    3.2 差异基因在体外成熟MⅡ卵母细胞与GV期卵母细胞中的mRNA表达量变化  37-38
  小结  38
  参考文献  38-41
第二章 IK对牛植入前胚胎发育的影响  41-56
  摘要  41-43
  1 材料与方法  43-44
    1.1 不同发育时期牛植入前胚胎的收集  43
    1.2 胚胎免疫荧光染色  43
    1.3 受精卵胞质Stealth RNAi~(TM) siRNA显微注射  43-44
    1.4 qPCR检测基因表达  44
    1.5 统计学分析  44
  2 结果  44-52
    2.1 不同发育时期牛植入前胚胎的收集  44
    2.2 IK在牛植入前胚胎中的蛋白表达  44-45
    2.3 IK stealth RNAi~(TM) siRNA干扰效率检测  45-46
    2.4 注射stealth RNAi~(TM) siRNA干扰IK对胚胎发育率的影响  46-47
    2.5 stealth RNAi~(TM) siRNA干扰IK表达对相关基因表达的影响  47-52
  3 讨论  52-54
  小结  54-55
  参考文献  55-56
第三章 IK对体外培养牛胎儿成纤维细胞的影响  56-78
  摘要  56-57
  1 材料与方法  57-62
    1.1 相关试剂及菌种  57
    1.2 IK过表达载体构建  57-59
    1.3 牛胎儿成纤维细胞的分离与培养  59
    1.4 牛胎儿成纤维细胞传代培养、冻存与复苏解冻培养  59-60
    1.5 牛胎儿成纤维细胞对G418及杀稻瘟菌素耐受性的检测  60-61
    1.6 脂质体Lipofectamine 2000转染牛胎儿成纤维细胞  61
    1.7 单克隆细胞的筛选  61-62
    1.8 统计学分析  62
  2 结果  62-74
    2.1 IK过表达载体的构建  62-65
    2.2 IK miRNA干扰载体设计  65-68
    2.3 组织块贴附法分离培养牛胎儿成纤维细胞  68
    2.4 牛胎儿成纤维细胞对G418和杀稻瘟菌素的耐受性检测  68-69
    2.5 脂质体转染牛胎儿成纤维细胞瞬时表达效果检测  69-72
    2.6 转基因单克隆细胞的筛选与检测  72-74
  3 讨论  74-76
    3.1 牛胎儿成纤维细胞原代与传代培养  74-75
    3.2 体细胞外源基因转染方法  75
    3.3 载体瞬时转染效率的鉴定  75-76
    3.4 IK对牛胎儿成纤维细胞的生长及相关基因的影响  76
  小结  76-77
  参考文献  77-78
总结  78-79
发表论文目录  79-80
致谢  80-81

IK细胞因子在牛植入前胚胎和牛胎儿成纤维细胞中的表达及作用

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