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猪胚胎干细胞分离培养与OCT4-eGFP示踪体系细胞筛选

作　者: 宋志强
导　师: 刘忠华
学　校: 东北农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 猪体外囊胚 ES细胞多能性 OCT4-eGFP
分类号: S852.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

胚胎干细胞（ESC）是一种多能性细胞，具有自我更新无限增殖的能力，具有向体内各胚层细胞分化的能力。嵌合实验表明，胚胎干细胞具有生殖系嵌合能力，将性状遗传到下一代，这也是胚胎干细胞独有的特性。应用这一特性，可嵌合生成基因修饰动物。基因修饰动物在基础医学的研究，药物实验的研究，疾病的研究有广泛的应用，因此胚胎干细胞在医学研究和动物性状改变研究有很重要的意义。目前，小鼠、大鼠和人胚胎干细胞技术已经成熟，而大动物还没有成熟的胚胎干细胞技术平台。猪是人类疾病的良好动物模型，也是异种器官移植的理想材料。而猪ESC作为研究性状改良、胚胎发育和医学模型的理想工具。因此，探索猪ESC细胞的适宜培养条件非常必要。本实验首先观察猪早期体外胚胎的形态和测量直径；通过降低孔板液体量提高囊胚贴壁率；比较双因子培养液和四因子培养液对猪ESC分离的影响；以得到的实验数据对分离真正的猪胚胎干细胞进行探讨。为了能直观的观察分离得到的猪ESC克隆的多能性基因表达和优化培养体系，我们利用TALEN介导同源重组，将带有2A肽序列的增强型绿色荧光蛋白（eGFP）基因及两侧带有LoxP位点的neo抗性基因定点插入Oct-4基因第5外显子的终止密码子处，利用内源性Oct4启动子驱动Oct4和eGFP表达，通过克隆技术得到精确模拟内源性Oct4表达的囊胚。已通过筛选获得OCT4-eGFP定点敲入细胞。经CRE酶处理后，该细胞制备的克隆囊胚在分离猪ESC过程中可借助OCT4-eGFP荧光标记来确定分离得到的pES克隆是否表达Oct4基因，有利于pES多能性鉴定和培养体系的优化。主要的实验方法和实验结果如下：第一部分我们对猪早期体外胚胎进行形态观察和直径测量。统计数据表明，猪体外早期胚胎的胚龄与直径成正比。同一胎龄的核移植胚胎、孤雌胚胎之间发育不同步，用胎龄对猪早期体外胚胎进行划分是不科学的。孤雌胚胎的贴壁率要高于核移植胚胎（37.1%，22.8%），降低孔板液体量可以有效的提高体外胚胎的贴壁效率（22.8%，59%）（P<0.05）。随后用猪体外胚胎进行胚胎干细胞的分离。实验设计两组培养液进行比较：用双因子培养液我们得到了上皮样集落，并传三个代次，但RT-PCR鉴定结果该细胞克隆表达Cdx2基因，并不表达Oct4基因。用四因子培养液分离得到2个小集落，集落传代后不增殖。第二部分通过剪取猪耳，建立猪耳成纤维细胞系WPF17-1和WPF17-2。耳成纤维细胞药物压力筛选结果显示300μg/mL浓度为筛选的适宜浓度。将构建好的Donor质粒线性化后与TALEN mRNA共同转染WPF17-1和WPF17-2两耳成纤维细胞系，通过新霉素和丙氧鸟苷的正负药物筛选，经过16天的连续筛选，获得细胞克隆13个，经鉴定获得4个阳性克隆。已获得OCT4-eGFP定点敲入细胞。

全文目录

摘要  8-9
Abstract  9-11
1 引言  11-19
  1.1 干细胞概述  11-13
    1.1.1 胚胎干细胞概述  11-12
    1.1.2 胚胎干细胞建系进展  12-13
  1.2 猪胚胎干细胞研究进展  13-14
  1.3 影响猪ESC建系的因素  14-16
  1.4 滋养层干细胞研究进展  16-17
  1.5 Oct4-eGFP 报告系统  17-18
  1.6 本研究的目的意义  18-19
2 材料与方法  19-31
  2.1 实验材料  19-23
    2.1.1 材料  19
    2.1.2 实验仪器  19-20
    2.1.3 实验试剂及配制  20-22
    2.1.4 实验耗材  22-23
  2.2 猪胚胎干细胞分离培养  23-27
    2.2.1 饲养层的准备  23-24
    2.2.2 猪核移植囊胚的获得  24
    2.2.3 猪孤雌囊胚的获得  24
    2.2.4 猪胚胎干细胞的分离  24
    2.2.5 猪滋养层干细胞样细胞分离培养  24-25
    2.2.6 猪滋养层干细胞样细胞的分子鉴定  25-27
  2.3 OCT4-eGFP 示踪模型细胞筛选  27-30
    2.3.1 猪耳成纤维细胞系的建立及培养  27
    2.3.2 猪成纤维细胞筛选压力曲线  27
    2.3.3 TALEN 工作效率检测  27-28
    2.3.4 细胞转染及筛选  28
    2.3.5 24 孔板细胞的 DNA 提取  28-29
    2.3.6 克隆点的分子鉴定  29-30
    2.3.7 阳性细胞的保存与复苏  30
  2.4 数据统计分析方法  30-31
3 结果与分析  31-39
  3.1 猪胚胎干细胞分离培养  31-36
    3.1.1 饲养层细胞  31
    3.1.2 猪早期体外胚胎发育情况的研究结果  31-32
    3.1.3 体外囊胚贴壁率的提高  32-33
    3.1.4 不同培养液分离猪胚胎干细胞的结果  33-34
    3.1.5 猪滋养层干细胞样细胞分离培养  34-36
  3.2 OCT4-eGFP 示踪体系细胞筛选  36-39
    3.2.1 猪耳成纤维细胞系建立  36
    3.2.2 猪耳成纤维细胞系对新霉素的压力曲线  36-37
    3.2.3 TALEN 工作效率检测  37
    3.2.4 OCT4-eGFP 示踪模型细胞的转染、筛选和鉴定  37-39
4 讨论  39-41
  4.1 囊胚质量对 ESC 建系的影响  39
  4.2 全胚培养法对 ESC 建系的影响  39
  4.3 建立真正的猪 ESC 细胞系  39-40
  4.4 OCT4-eGFP 示踪体系  40-41
5 结论  41-42
致谢  42-43
参考文献  43-49
附录  49-52
攻读学位期间发表的学术论文  52

猪胚胎干细胞分离培养与OCT4-eGFP示踪体系细胞筛选

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