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胡杨microRNA Peu-miR156j和Peu-miR169o表达模式分析及功能鉴定

作　者: 段中鑫
导　师: 尹伟伦; 夏新莉
学　校: 北京林业大学
专　业: 植物学
关键词: 胡杨脱水高盐超表达 peu-miR156j peu-miR169o
分类号: S792.119
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

MicroRNAs又称miRNAs,是普遍存在于真核生物细胞中的一类非编码、长度约16-29个核苷酸的小分子RNA。miRNA通过对靶基因mRNA的降解或翻译抑制来调控真核细胞基因的表达。近年来发现其在生物体内有着很重要的调节功能,包括生长发育、激素反应、病毒诱导和逆境胁迫等众多方而。胡杨(Populus euphratica)是我国干旱荒漠区唯一自然成林的高大乔木树种,胡杨具有耐盐碱、耐贫瘠、抗旱等较强抗逆性。研究非生物逆境胁迫相关的胡杨miRNAs的调控机制,可以为培育高抗逆性新品种提供依据,具有重要的基础研究和应用研究价值。本实验基于实验室前人研究的基础上,以胡杨peu-miR156j和peu-miR169o作为研究对象。利用RT-PCR半定量和SYBR Green RT-PCR实时定量这两种方法分析了胡杨在脱水与高盐逆境胁迫下peu-miR156j和peu-miR169o的表达模式。结果表明,在上述两种非生物逆境胁迫下peu-miR156j和peu-miR169o均出现不同程度的表达上调,说明它们可能参与调控脱水与高盐逆境过程。为了进一步探索胡杨peu-miR156和peu-miR169的生物功能,本实验克隆了胡杨peu-miR156j和peu-miR169o(?)巧个前体基因并构建了相应的超量表达载体,从面获得了相应的35S.MIR156j和35S:MIR169o转基因植株。研究表明,35S:MIR156j增加了拟南芥莲座叶的发生,导致叶片浓密及开花延迟,并且在盐处理下的萌发率与生长状况优于野生型,同时miR156j还负调控靶基因SPL6、SPL9及SPL11。基于上述结果本研究推断miR156j可能通过调控与逆境胁迫相关的靶基因STRS2(逆境响应抑制物2)而发挥耐盐功能的分子机制。35S:MIR169o植株在形态上与野生型基本一致,但是盐处理下的萌发率以及存活率要明显高于野生型,并且在高盐逆境处理后野生型植株较早出现叶片萎焉,说明转基因植株具有更高的耐盐能力。在预测的靶基因中NF-YA1, NF-YA2和NF-YA8受miR169o负调控,说明这三种靶基因可能参与miR169o调控耐盐功能的分子机制。本研究对胡杨peu-miR156j和peu-miR169o的功能进行了初步鉴定,为以后进一步开展miRNA抗逆基因工程提供了依据。

全文目录

摘要  3-4
ABSTRACT  4-6
縮略词表  6-7
目录  7-10
引言  10-11
1 文献综述  11-26
  1.1 miRNA研究现状  11-24
    1.1.1 植物miRNA的发现  11-13
    1.1.2 植物miRNA的生物合成  13-14
    1.1.3 植物miRNA的特点  14-15
    1.1.4 植物miRNA的鉴定  15-18
      1.1.4.1 传统的测序分析方法  16
      1.1.4.2 高通量测序分析方法  16-17
      1.1.4.3 生物信息学分析方法  17-18
    1.1.5 植物miRNA的验证  18-19
      1.1.5.1 Northern blotting  18-19
      1.1.5.2 Stem-loop qRT-PCR  19
      1.1.5.3 miRNA基因芯片  19
    1.1.6 植物miRNA靶基因的预测及验证  19-21
      1.1.6.1 植物miRNA靶基因的预测  20
      1.1.6.2 植物miRNA靶基因的验证  20-21
    1.1.7 植物miRNA的生物学功能  21-24
      1.1.7.1 植物miRNA与生长发育的关系  22-23
      1.1.7.2 植物miRNA与逆境的关系  23-24
  1.2 研究的目的意义  24-26
2 胡杨Peu-miR156j和Peu-miR169o成熟体的表达分析  26-34
  2.1 材料与方法  26-29
    2.1.1 植物材料处理  26
    2.1.2 脱水和高盐胁迫处理下胡杨Peu-miR156j和Peu-miR169o的表达分析  26-29
      2.1.2.1 CTAB-Tris法提取胡杨总RNA  26-27
      2.1.2.2 胡杨Peu-miR156j和Peu-mi169o半定量RT-PCR及实时定量RT-PCR引物设计  27-28
      2.1.2.3 胡杨Peu-miR156j和Peu-miR169o成熟体的反转录(RT)反应  28-29
      2.1.2.4 胡杨Peu-miR156j和Peu-miR169o的半定量及实时荧光定量PCR反应  29
      2.1.2.5 实时荧光定量PCR数据标准化处理  29
  2.2 结果与分析  29-33
    2.2.1 胡杨Peu-miR156j和Peu-miR169o成熟体的实时荧光定量数据处理  29-32
    2.2.2 胡杨成熟体Peu-miR156j和Peu-miR169o成熟体的半定量RT-PCR处理  32-33
  2.3 讨论  33-34
3 胡杨PEU-MIR156J和PEU-MIR1690转基因及功能验证  34-59
  3.1 胡杨Peu-miR156j和Peu-miR169o的克隆及分析  34-40
    3.1.1 材料与方法  34-35
      3.1.1.1 植物材料  34
      3.1.1.2 仪器和试剂  34
      3.1.1.3 培养基及抗生索  34-35
    3.1.2 胡杨Peu-miR156j和Peu-miR169o的克隆  35-38
      3.1.2.1 胡杨总DNA提取  35
      3.1.2.2 PCR扩增  35-36
      3.1.2.3 目的片段的回收与纯化  36-37
      3.1.2.4 目的片段连入载体  37-38
      3.1.2.5 转化  38
      3.1.2.6 大肠杆菌单克隆送测  38
    3.1.3 胡杨Peu-miR156j和Peu-miR169o基因分析  38
    3.1.4 比对与分析  38-40
      3.1.4.1 胡杨Peu-miR156j和Peu-miR169o前体DNA序列比对  38-39
      3.1.4.2 胡杨Peu-miR156j和Peu-miR169o前体二级结构分析  39-40
  3.2 目的基因的酶切与农杆菌转化  40-45
    3.2.1 实验材料及试剂  40-41
    3.2.2 实验方法  41-45
      3.2.2.1 连入酶切位点的目的基因  41-42
      3.2.2.2 DNA的回收与纯化  42
      3.2.2.3 目的片段与pMD19-T Simple Vector载体连接  42
      3.2.2.4 转化大肠杆菌感受态  42
      3.2.2.5 大肠杆菌阳性克隆的PCR鉴定  42
      3.2.2.6 质粒DNA提收  42-43
      3.2.2.7 双酶切及连接体系  43-44
      3.2.2.8 转化、PCR检测及质粒提取  44
      3.2.2.9 农杆菌感受态细胞的制备及农杆菌转化  44
      3.2.2.10 农杆菌菌液PCR检测  44-45
      3.2.2.11 农杆菌的活化与培养  45
  3.3 胡杨Peu-miR156j和Peu-miR169o基因转化拟南芥  45-49
    3.3.1 实验材料  45
    3.3.2 拟南芥的播种与管理  45-46
    3.3.3 农杆菌介导的拟南芥侵染转化  46-47
    3.3.4 转基因植株的筛选与检测  47-49
      3.3.4.1 转基因植株的筛选  47
      3.3.4.2 转基因拟南芥分子检测  47-48
      3.3.4.3 T3代转基因拟南芥植株功能鉴定  48
      3.3.4.4 靶基因预测  48
      3.3.4.5 靶基因表达分析  48-49
  3.4 结果与分析  49-57
    3.4.1 胡杨Peu-miRl56j和Peu-miR169o的克隆及载体构建  49-50
    3.4.2 T1代转基因拟南芥的分子鉴定  50
    3.4.3 35S：MIR156j转基因植株的表型  50-51
    3.4.4 35S：MIR156j和35S：MIR169o转基因植株抗盐性检测  51-54
      3.4.4.1 35S：MIR156j转基因与野生型拟南芥在盐处理及空MS处理下的萌发率  51-52
      3.4.4.2 355：MIR169o转基因与野生型拟南芥在盐处理及空MS处理下的萌发率  52-54
    3.4.5 miR156j和miR169o在拟南芥中靶基因的预测及表达分析  54-57
      3.4.5.1 miR156j在拟南芥中靶基因的预测及表达分析  54-55
      3.4.5.2 miR169o在拟南芥中靶基因的预测及表达分析  55-57
  3.5 讨论  57-59
4 结论与展望  59-61
  4.1 结论  59-60
  4.2 展望  60-61
    4.2.1 创新点  60
    4.2.2 进一步研究的内容  60-61
参考文献  61-68
个人简介  68
攻读硕士学位期间发表论文  68-69
导师简介  69-70
致谢  70

胡杨microRNA Peu-miR156j和Peu-miR169o表达模式分析及功能鉴定

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