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丹参酮生物合成调控机理及丹参与绒毛鼠尾草cDNA-AFLP分析研究

作　者: 杨东风
导　师: 梁宗锁
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 药用植物学
关键词: 丹参 cDNA-AFLP PEG信号 ABA
分类号: S567.53
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


丹参（Salvia miltiorrhiza）为唇形科植物丹参的根及根茎，是我国大宗药材之一，已经广泛应用于冠心病、慢性肾功能衰竭、动脉硬化、心肌梗塞、心绞痛和心肌缺血等疾病的预防和治疗。丹参有效成分主要包括酚酸类和丹参酮类两类成分。前者主要有丹酚酸B，丹参素、原儿茶醛、咖啡酸和迷迭香酸等，为水溶性成分。后者主要有丹参酮ⅡA,隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和二氢丹参酮Ⅰ等，为脂溶性成分。丹参酮类成分为二萜类化合物，其在植物体内合成主要包括细胞质中的甲羟戊酸（mevalonate， MVA）途径和质体中的2C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸途径（2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate，MEP）途径，区别在于二者合成异戊烯基焦磷酸酯（isopentenyl diphosphate，IPP）的前体、机制、位置和终产物不同。MVA途径以乙酰辅酶A为前体，合成IPP，可进一步形成甾体、倍半萜和三萜等。其中3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase，HMGR）是该途径的限速酶，催化甲羟戊酸的不可逆生成，洛伐它丁（mevinolin，MVA）是该酶的专一性抑制剂。MEP途径以5-磷酸脱氧木酮糖和2C-甲基4-磷酸-4D-赤藓糖醇为前体，合成IPP，并进一步缩合形成单萜、二萜和四萜。1-去氧木糖-5-磷酸还原酶（1-deoxy-D-xylulose5-phosphate reductoisomerase，DXR）是该途径的限速酶，催化1-脱氧-木酮糖-5-磷酸(1-deoxy-D-xyulose5-phosphate，DXP)可逆形成MEP，磷甘霉素（fosmidomycin，FOS）是该酶的专一性抑制剂。为了探讨丹参酮在植物体内的合成机制，我们采用毛状根培养体系，研究了丹参酮合成抑制剂MEV和FOS，及IPP吸收抑制剂D, L-甘油醛（D, L-glyceraldehyde，DLG）和焦磷酸钠（sodium pyrophosphate，NAPP）对毛状根生长和丹参酮积累的影响。在盆栽试验中，我们已经证明干旱胁迫有利于丹参酮类成分的积累，本研究采用毛状根培养体系，对聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）和脱落酸（abscisic acid，ABA）诱导丹参酮的合成机制进行了探讨，同时对ABA、活性氧、茉莉酸和一氧化氮等信号物质在PEG诱导丹参酮积累中的作用进行了研究。藏丹参又称绒毛鼠尾草（Salvia castanea diels f. Tomentosa stib），为栗色鼠尾草的变形，原产于西藏林芝地区，生长在海拔1950-3750米之间。我们前期的研究结果表明藏丹参中丹参酮类成分含量较高，但丹酚酸B含量较低。丹参根多为砖红色，但也常发现一些根色较浅的丹参，如白根丹参。本研究首先对藏丹参、紫花丹参、白根紫花丹参以及水培紫花丹参的代谢图谱进行了研究，进而对其差异表达基因进行cDNA-AFLP分析，以期发现一些与丹参酮和丹酚酸合成相关的新基因。主要结论如下：1. MEV和FOS均能抑制丹参毛状根的生长，MEV的抑制作用较强，NAPP明显促进了毛状根生长，DLG对毛状根生长影响较小，但却能增强MEV和FOS的抑制作用。对8个丹参脂溶性成分峰进行分析可知，除了3号峰，其它7个峰成分的积累能被MEV抑制，除了4号峰，其它7个峰成分的积累被FOS抑制，但FOS对峰1-3、5，6和8的抑制效果要远强于MEV。DLG和NAPP能够抑制大部分丹参酮类成分的积累，但两抑制剂对不同成分的抑制效果不同。DLG能够显著增强MEV和FOS对丹参酮的抑制作用。HMGR和DXR基因表达在MEV和FOS在处理6h迅速上升，但24后急剧下降。总之，MVA途径与毛状根生长关系更为密切。尽管MVA途径在丹参酮类成分合成中都起着重要作用，但大部分丹参酮类成分的合成主要来源于MEP途径。IPP转运在丹参酮合成中也起着重要作用，两条途径通过协同交流，共同调控丹参酮的合成。2. PEG和ABA均能抑制丹参毛状根的生长，诱导丹参酮类成分的积累。MEP途径抑制剂FOS能够明显抑制PEG和ABA的诱导作用，说明PEG和ABA可能主要通过MEP途径促进丹参酮积累。但MVA途径抑制剂也能够部分抑制丹参酮的积累，特别是能够明显抑制ABA诱导二氢丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA的积累，同时MVA途径关键基因HMGR在PEG和ABA胁迫下，其表达明显上调，说明MVA在PEG和ABA诱导丹参酮积累中也起到一定的作用。3.茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MJ）和硝普钠（sodium nitroprusside，SNP）均能够诱导丹参酮类成分的积累，与其它丹参酮成分相比，隐丹参酮积累对MJ较为为敏感，隐丹参酮和丹参酮IIA积累对SNP则较为敏感。MJ诱导了活性氧（reactive oxygenspecies，ROS）的爆发，但SNP对活性氧积累影响不明显。MJ和SNP均能诱导HMGR和DXR基因表达上调。活性氧清除剂超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和过氧化氢酶（catalase，CAT）显著抑制了MJ对丹参酮的诱导作用，而对SNP诱导丹参酮的积累影响不显著，说明MJ可能主要通过ROS信号诱导了丹参酮的积累。4. PEG和ABA能够明显促进毛状根中H2O2和O2-的积累，活性氧清除剂CAT和SOD明显抑制了PEG和ABA对丹参毛状根生长的抑制及丹参酮积累的促进作用。说明PEG和ABA胁迫促进了植物体内活性氧爆发，进而诱导丹参酮积累。5. PEG和ABA胁迫均能够促进毛状根中茉莉酸甲酯的积累，茉莉酸合成抑制剂布洛芬（ibuprofen，IBU）和ABA合成抑制剂钨酸钠（tungaste，TUN）明显抑制了PEG和ABA对丹参酮积累和HMGR与DXR基因表达的促进作用。，IBU和FOS能够抑制茉莉酸甲酯对丹参酮积累的促进作用，而钨酸钠和MEV却没有影响。同时茉莉酸甲酯也诱导了HMGR和DXR基因的上调表达。说明内源茉莉酸信号和ABA信号可能介导了PEG和ABA对丹参酮的诱导作用，而外源茉莉酸未通过ABA信号，而是直接通过内源茉莉酸信号诱导MEP途径，进而促进丹参酮积累。6. PEG和ABA均促进了毛状根中NO的合成，内源NO合成抑制剂L-NAME和NO清除剂c-PTIO能够明显抑制PEG和ABA对丹参酮积累和HMGR与DXR基因表达的促进作用，SNP对四种丹参酮积累均有促进作用，FOS对SNP诱导的四种丹参酮的积累均具有显著地抑制作用，MEV则仅对部分丹参酮的积累有抑制作用。这说明NO信号很可能介导了PEG和ABA对丹参酮的诱导作用，而SNP主要通过MEP途径诱导了丹参酮合成。7.藏丹参中丹参酮类成分和迷迭香酸含量较高，丹酚酸B含量较低。白根丹参和水培丹参中未检测到脂溶性成分，但水溶性成分含量较高。8.通过cDNA-AFLP分析，在水培丹参和正常紫花丹参间共发现928条差异表达序列，其中391条在正常丹参中特异表达，537条在水培丹参中特异表达。在白根丹参和正常丹参间共发现596条TDFs，其中217条在白根丹参中特异表达，379条在正常丹参中特异表达。在紫花丹参和藏丹参间共发现776条TDFs，其中385条在藏丹参中特异表达，291条在在正常丹参中特异表达。我们选取了975条TDFs进行分离二次扩增，最终选取573条进行测序。结果有323条TDFs测序成功。通过BLASTX比对分析，66%的TDFs未找到同源序列，109条TDFs具有同源序列（eValue≤10-5）。采用Blast2GO软件进行GO分类注释，结果有86条TDFs能够注释成功。其中60%的TDFs与生物过程相关，包括细胞代谢、初生代谢和生物合成过程等。有67条TDFs与分子功能相关，包括核酸结合、氧化还原酶、蛋白结合和转移酶活性相关基因。有60%TDFs与细胞组成相关，包括质体、叶绿体和结合于细胞质膜的液泡等。采用基于KEGG数据库的通径分析，可知共有27条TDFs与KEGG数据库中的酶具有同源性，其中22条TDFs与代谢途径匹配成功，与次生代谢途径相关的有14条。由于酵母诱导子能够诱导丹酚酸和丹参酮的合成及相关基因的高表达，我们选取了16条TDFs进行RT-PCR分析，结果有9条TDFs表达被酵母诱导子诱导上调，其中包括LOX基因、JAZ蛋白基因、丙酮酸脱羧酶基因、过氧化氢酶基因、HD转录因子基因、二氢黄酮醇还原酶基因以及三个未知基因，这些基因都可能与丹参次生代谢有关。

全文目录


摘要  5-8
ABSTRACT  8-16
第一章 功能基因组学在植物次生代谢中的应用研究进展  16-25
  1.1 引言  16-17
  1.2 发现新基因  17-20
  1.3 鉴定基因功能  20-21
  1.4 探索新合成途径  21-22
  1.5 代谢网络  22-23
  1.6 讨论与展望  23-25
第二章 MVA 和 MEP 途径抑制剂对丹参毛状根生长及丹参酮积累的影响  25-42
  2.1 引言  25-28
  2.2 材料与方法  28-30
    2.2.1 毛状根培养与抑制剂处理  28
    2.2.2 丹参酮提取及含量测定  28-29
    2.2.3 RNA 分离、cDNA 合成及荧光实时定量分析  29-30
  2.3 结果  30-38
    2.3.1 抑制剂对丹参毛状根生长的影响  30-32
    2.3.2 抑制剂对丹参毛状根中丹参酮积累的影响  32-35
    2.3.3 抑制剂对培养基中丹参酮释放的影响  35-37
    2.3.4 抑制剂对丹参酮合成相关基因表达的影响  37-38
  2.4 讨论  38-42
    2.4.1 MVA 途径在丹参毛状根生长中起着重要作用  38-39
    2.4.2 丹参酮类成分合成主要来源于 MEP 途径  39-40
    2.4.3 MVA 和 MEP 途径交流在丹参酮合成中起着重要作用  40-42
第三章 PEG 和 ABA 处理对丹参毛状根中丹参酮积累的影响  42-51
  3.1 引言  42-43
  3.2 材料与方法  43-44
    3.2.1 诱导子及抑制剂的制备  43
    3.2.2 毛状根培养及处理  43
    3.2.3 丹参酮的提取与 HPLC 定量分析  43-44
    3.2.4 RNA 分离、cDNA 合成及荧光实时定量分析  44
  3.3 结果  44-49
    3.3.1 PEG 和 ABA 对丹参毛状根生长的影响  44-45
    3.3.2 不同浓度 PEG 和 ABA 处理对丹参酮积累的影响  45-47
    3.3.3 抑制剂对 PEG 和 ABA 处理条件下丹参酮积累的影响  47-48
    3.3.4 PEG 和 ABA 对丹参毛状根 HMGR 和 DXR 基因表达的影响  48-49
  3.4 讨论  49-50
  3.5 结论  50-51
第四章 活性氧在 PEG 和 ABA 诱导丹参毛状根中丹参酮积累中的作用  51-58
  4.1 引言  51-52
  4.2 材料与方法  52-54
    4.2.1 毛状根培养及处理  52
    4.2.2 活性氧测定  52-53
    4.2.3 丹参酮的提取与 HPLC 定量分析  53
    4.2.4 RNA 分离、cDNA 合成及荧光实时定量分析  53-54
  4.3 结果  54-56
    4.3.1 ROS 清除剂对 PEG 和 ABA 处理条件下丹参毛状根生长的影响  54
    4.3.2 活性氧清除剂对 PEG 和 ABA 诱导丹参酮积累的影响  54-55
    4.3.3 活性氧清除剂对丹参毛状根 HMGR 和 DXR 基因表达的影响  55-56
    4.3.4 PEG 和 ABA 对丹参毛状根活性氧积累的影响  56
  4.4 讨论  56-57
  4.5 结论  57-58
第五章 活性氧在茉莉酸甲酯和一氧化氮诱导丹参毛状根中丹参酮积累中的作用  58-68
  5.1 引言  58-59
  5.2 材料与方法  59-61
    5.2.1 毛状根培养及处理  59
    5.2.2 活性氧测定  59-60
    5.2.3 丹参酮的提取与 HPLC 定量分析  60
    5.2.4 RNA 分离、cDNA 合成及荧光实时定量分析  60-61
  5.3 结果  61-66
    5.3.1 茉莉酸甲酯和一氧化氮对丹参毛状根生长的影响  61
    5.3.2 茉莉酸甲酯和一氧化氮对丹参酮积累的影响  61-63
    5.3.3 活性氧清除剂对茉莉酸甲酯和一氧化氮诱导丹参酮积累的影响  63-64
    5.3.4 茉莉酸甲酯和一氧化氮对丹参毛状根中活性氧积累的影响  64-65
    5.3.5 茉莉酸甲酯和一氧化氮对丹参毛状根 HMGR 和 DXR 基因表达的影响  65-66
  5.4 讨论  66
  5.5 结论  66-68
第六章 茉莉酸甲酯在 PEG 和 ABA 诱导丹参毛状根丹参酮积累中的作用  68-78
  6.1 引言  68-69
  6.2 材料与方法  69-71
    6.2.1 诱导子与抑制剂的制备  69
    6.2.2 毛状根培养及处理  69-70
    6.2.3 丹参酮的提取与 HPLC 定量分析  70
    6.2.4 茉莉酸甲酯的测定  70
    6.2.5 RNA 分离、cDNA 合成及荧光实时定量分析  70-71
  6.3 结果  71-75
    6.3.1 钨酸钠和布洛芬对 PEG 诱导丹参酮积累的影响  71
    6.3.2 钨酸钠和布洛芬对 ABA 诱导丹参酮积累的影响  71-72
    6.3.3 钨酸钠和布洛芬对 MJ 诱导丹参酮积累的影响  72-73
    6.3.4 MVA 和 MEP 途径抑制剂对 MJ 诱导丹参酮积累的影响  73-74
    6.3.5 PEG 和 ABA 对茉莉酸甲酯积累的影响  74
    6.3.6 PEG、ABA 和 MJ 对 HMGR 和 DXR 基因表达的影响  74-75
  6.4 讨论  75-77
  6.5 结论  77-78
第七章 一氧化氮信号在 PEG 和 ABA 诱导丹参毛状根中丹参酮积累中的作用  78-86
  7.1 引言  78-79
  7.2 材料与方法  79-81
    7.2.1 诱导子与抑制剂的制备  79
    7.2.2 毛状根培养及处理  79-80
    7.2.3 NO 测定  80
    7.2.4 丹参酮的提取与 HPLC 定量分析  80
    7.2.5 RNA 分离、cDNA 合成和荧光实时定量分析  80-81
  7.3 结果  81-84
    7.3.1 L-NAME 和 c-PTIO 对 PEG 和 ABA 诱导丹参同积累的影响  81
    7.3.2 PEG 和 ABA 处理丹参毛状根中 NO 的积累  81-83
    7.3.3 L-NAME 和 c-PTIO 对 PEG 和 ABA 诱导 HMGR 和 DXR 基因表达的影响  83
    7.3.4 洛伐它丁和磷甘霉素对 SNP 诱导丹参酮积累的影响  83-84
  7.4 讨论  84-85
  7.5 结论  85-86
第八章 藏丹参与紫花丹参 HPLC 代谢图谱的研究  86-93
  8.1 引言  86
  8.2 材料与方法  86-87
    8.2.1 材料与试剂  86-87
    8.2.2 样品制备  87
    8.2.3 HPLC 分析  87
  8.3 结果  87-92
    8.3.1 进样精密度实验  87
    8.3.2 方法重现性实验  87
    8.3.3 样品稳定性实验  87-88
    8.3.4 回收率实验  88
    8.3.5 线性实验  88
    8.3.6 藏丹参与紫花丹参 HPLC 分析  88-90
    8.3.7 白根丹参 HPLC 图谱  90-91
    8.3.8 水培丹参 HPLC 图谱  91-92
  8.4 结论  92-93
第九章 藏丹参与紫花丹参 cDNA-AFLP 分析  93-115
  9.1 引言  93-95
  9.2 材料与方法  95-105
    9.2.1 材料  95-96
    9.2.2 cDNA-AFLP 分析  96-102
    9.2.3 诱导子和抑制剂的制备  102-103
    9.2.4 毛状根培养及处理  103
    9.2.5 丹参酮及丹酚酸类成分的提取及 HPLC 分析  103
    9.2.6 RNA 分离、cDNA 合成及荧光实时定量分析  103-105
  9.3 结果  105-113
    9.3.1 RNA 提取  105-106
    9.3.2 内切酶的选择  106
    9.3.3 差异表达基因的获得  106-110
    9.3.4 酵母诱导子对丹参毛状根次生代谢产物积累与基因表达的影响  110-112
    9.3.5 酵母诱导子诱导丹参毛状根差异表达片段的表达  112-113
  9.4 讨论  113-114
  9.5 结论  114-115
第十章 总结论  115-117
参考文献  117-137
附表  137-150
致谢  150-151
作者简介  151-152

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 经济作物 > 药用作物 > 喜阴药物 > 其他
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