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黄芩毛状根的诱导及黄芩苷分离纯化的研究

作　者: 李红波
导　师: 张东向
学　校: 齐齐哈尔大学
专　业: 植物学
关键词: 黄芩发根农杆菌毛状根响应面分析法黄芩苷
分类号: S567.239
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

黄芩为唇形科(Labiatae)植物黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)的干燥根，是常用中药，性寒、味苦。具有清热燥湿、泻火解毒、止血安胎等功效。黄芩多见于阳光充足的向阳山坡、林缘、稀疏草丛中，耐热、耐寒、耐旱、忌积水，-35℃安全越冬，能耐35℃的高温。黄芩的主要有效成分黄芩苷(Baicalin)，是从黄芩根中提取分离出来的一种黄酮类化合物，具有显著的生物活性。近年来，黄芩的药用量逐年上升，有限的野生资源遭到了掠夺性采挖，资源短缺使其价格居高不下。黄芩毛状根的培养将使黄芩苷生产实现工业化，有着重要的经济价值。本课题运用遗传转化和组织培养技术，采用共培养法，利用发根农杆菌（Agrobacterizum rhizogenes）1.2556中的Ri质粒侵染不同的黄芩外植体，诱导产生毛状根。并探讨了转化过程中外植体、预培养、侵染时间、乙酰丁香酮等因素对毛状根诱导率的影响。在单因素实验的基础上，利用Box-Benhnkcn设计和响应面分析法对培养时间、培养温度、摇床转速、接种量等影响培养条件的因素进行分析，建立黄芩毛状根的离体培养体系。对Ri质粒介导的黄芩毛状根中的黄芩苷应用大孔吸附树脂进行分离与纯化，纯化后的黄芩苷用高效液相色谱法进行检测。研究表明，通过共培养法实现了黄芩毛状根的遗传转化。毛状根密集簇生，无向地性，普遍水平生长，在无外源激素的MS培养基上自主生长，表现出典型的发根特征。外植体黄芩茎段、根段等均能产生毛状根，但茎段诱导率最高，可达到47%。黄芩外植体预培养两天，侵染时间为10-15min，添加100μmol/L的乙酰丁香酮，共培养两天最佳。在MS培养基中加入400mg/L抗生素头孢曲松钠能较好地抑制发根农杆菌生长，提高黄芩外植体的诱导率。通过对毛状根鲜重量的比较，优化出毛状根的最优培养条件为：1/2MS培养基中，加入30g/L蔗糖，pH值6.0、培养时间25d、温度27.4℃、摇床转速123r/min、接种量0.5g，黑暗下培养，有利于毛状根生长及次级代谢产物黄芩苷的生物合成。通过大孔吸附树脂法对黄芩毛状根提取液进行分离与纯化，确定黄芩毛状根提取液中含有黄芩苷；运用HPLC对纯化后的黄芩苷检测表明，培养25天的黄芩毛状根中黄芩苷的含量可达5.37%。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-12
1 绪论  12-25
  1.1 引言  12
  1.2 黄芩的研究进展  12-16
    1.2.1 黄芩简介  12-13
    1.2.2 中药化学成分  13-14
    1.2.3 中药黄芩的药理作用  14-16
  1.3 转基因技术和发根农杆菌  16-19
    1.3.1 转基因技术  16-17
    1.3.2 发根农杆菌  17-18
    1.3.3 Ri 质粒  18-19
  1.4 毛状根研究现状  19-21
    1.4.1 毛状根的特性  19
    1.4.2 发根农杆菌诱导植物形成毛状根的机制  19
    1.4.3 发根农杆菌诱导植物形成毛状根的方法  19-20
    1.4.4 毛状根的除菌  20
    1.4.5 毛状根的鉴定  20
    1.4.6 毛状根培养技术的应用  20-21
  1.5 黄芩毛状根培养条件的优化  21-22
    1.5.1 影响黄芩毛状根生长的多种因素  21-22
    1.5.2 响应面分析法在优化培养条件中的应用  22
  1.6 毛状根中黄芩苷的提取、分离与纯化  22-23
    1.6.1 黄芩苷的提取  22-23
    1.6.2 黄芩苷的分离与纯化  23
  1.7 HPLC 检测毛状根中黄芩苷的含量  23-24
  1.8 本课题研究的目的与意义  24-25
2 黄芩毛状根的诱导及鉴定  25-36
  2.1 实验材料  25-26
    2.1.1 植物材料  25
    2.1.2 供试发根农杆菌菌种  25
    2.1.3 主要仪器与设备  25
    2.1.4 主要试剂与药品  25-26
    2.1.5 培养基  26
  2.2 实验方法  26-28
    2.2.1 外植体的制备  26
    2.2.2 发根农杆菌的培养  26-27
    2.2.3 外植体的预培养  27
    2.2.4 毛状根除菌用抗菌素的确定  27-28
  2.3 结果与分析  28-32
    2.3.1 黄芩无菌苗和外植体的制备  28
    2.3.2 发根农杆菌的保存方法及培养条件的确定  28-29
    2.3.3 毛状根除菌用抗菌素的确定  29
    2.3.4 影响黄芩毛状根的诱导率的因素  29-31
    2.3.5 黄芩毛状根的鉴定  31-32
  2.4 讨论  32-36
3 黄芩毛状根培养条件的优化  36-46
  3.1 实验材料  36
    3.1.1 植物材料  36
    3.1.2 主要仪器与设备  36
    3.1.3 主要试剂与药品  36
  3.2 实验方法  36-37
    3.2.1 单因素实验设计  36-37
    3.2.2 响应面分析法对毛状根培养条件进行优化  37
  3.3 结果与分析  37-45
    3.3.1 不同因素对黄芩毛状根生长状况的影响  37-40
    3.3.2 响应面分析法优化黄芩毛状根的培养条件  40-44
    3.3.3 验证实验  44-45
  3.4 讨论  45-46
4 毛状根中黄芩苷的提取、分离与纯化  46-56
  4.1 实验材料  46-47
    4.1.1 植物材料  46
    4.1.2 主要仪器与设备  46
    4.1.3 主要试剂与药品  46-47
  4.2 实验方法  47-49
    4.2.1 黄芩提取液的制备  47
    4.2.2 黄芩苷的分离与纯化  47-48
    4.2.3 高效液相测定纯化后的黄芩苷含量  48-49
  4.3 结果与分析  49-55
    4.3.1 黄芩提取液的制备  49-50
    4.3.2 黄芩苷标准品最大吸收波长的确定  50
    4.3.3 不同种类大孔树脂对黄芩苷吸附效果的影响  50-51
    4.3.4 上样质量浓度和上样量的选择  51-52
    4.3.5 洗脱剂浓度和用量的确定  52-53
    4.3.6 高效液相测定纯化后的黄芩苷含量  53-55
  4.4 讨论  55-56
结论  56-57
参考文献  57-63
附录  63-68
攻读硕士学位期间发表学术论文情况  68-69
致谢  69-70

黄芩毛状根的诱导及黄芩苷分离纯化的研究

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