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利用基因枪转化技术创造抗病大豆新材料

作　者: 王鹏飞
导　师: 刘丽君
学　校: 东北农业大学
专　业: 遗传学
关键词: hrpZ基因 体细胞胚 基因枪法 植物抗病基因工程 分子生物学检测
分类号: S565.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


大豆是世界上重要的经济作物，随着人口的增长对大豆的需求量在不断的增加。病害一直是严重影响大豆产量和品质的重要因素之一，危害根部病害主要是：立枯病、猝倒病、萎枯病,据调查每年由于根腐病造成大豆减产在10%左右,严重影响大豆产业的发展。因此，如何提高大豆的抗病性是人们亟待解决的问题，传统育种方式虽然能解决大豆的抗病性，但是需要的时间长，新培育的品种抗性比较单一，通过栽培管理和喷施农药在一定程度上能够减少大豆病害的影响，但是长期喷施农药不仅污染环境,而且会提高植物病原菌的抗药能力。随着分子生物学的发展，人们对植物抗病基因工程研究的不断深入，人们可以有目的的将抗病基因转入植物体内，用来提高植物广谱的、持久的抗病能力。同时还为大豆的育种提供新的种质资源,植物病原细菌的hrp (hypersensitive reaction and pathogenicity gene)基因编码harpin蛋白能诱导植物产生一系列抗性反应，使植物获得广谱的抗病能力和促进植物的生长。Harpin蛋白是受hrp基因调节并通过Ⅲ型泌出通道分泌的一类蛋白质,它们的共同特点是：富含甘氨酸，对热稳定，对蛋白酶敏感。hrpZPsta是从丁香假单胞菌烟草致病变种(Pseudomonassyringae pv.tabaci) Psta218菌株中克隆,该基因大小约为420bp，能在烟草上引起过敏反应诱导植物的抗病性。体细胞胚是基因枪转化方法重要的靶组织，主要是通过未成熟子叶体细胞胚诱导途径发生，体细胞胚的诱导对大豆的基因型有很大的依赖性。不同大豆基因型诱导体细胞胚的质量是有差异的。基因枪转化方法不仅转化效率高且操作简单，是大豆重要的遗传转化方法之一。本试验构建了pDT-hrpZ植物表达载体，选取北方41个春大豆进行体细胞胚诱导，利用基因枪方法将hrpZ基因转入大豆未成熟子叶体细胞胚中。并对转基因植株进行了分子生物学检测。结果表明：1.垦丰23的体细胞胚的发生率最高为99.7%,并且体细胞胚鲜绿色呈葡萄状、每个未成熟子叶上的体细胞胚数目多，是大豆遗传转化理想受体材料。体细胞胚发生率为70%～90%有合丰55等9个基因型；登科4等5个基因型无体细胞胚发生率。2.以垦丰23为受体，采用基因枪转化技术,PCR检测，获得转化质粒pDT-hrpZ的T0转基因植株11株。3.利用荧光定量PCR对11株转基因植株进行实时检测，hrpZ在转基因植株均有不同程度的表达。

全文目录


摘要  8-9
Abstract  9-11
1 前言  11-24
  1.1 研究目的及意义  11
  1.2 文献综述  11-24
    1.2.1 作物抗病育种现状  11-12
    1.2.2 植物抗病基因工程的研究进展  12-18
    1.2.3 转基因大豆研究进展  18-19
    1.2.4 大豆遗传转化方法  19-22
    1.2.5 再生系统  22-24
2 材料与方法  24-36
  2.1 材料  24-26
    2.1.1 菌株与质粒  24
    2.1.2 受体材料  24
    2.1.3 生化试剂  24-25
    2.1.4 培养基  25
    2.1.5 仪器  25-26
  2.2 试验方法  26-36
    2.2.1 植物表达载体 pDT-hrpZ 构建  26-28
    2.2.2 大豆再生体系的建立  28-29
    2.2.3 用基因枪法转化大豆体细胞胚  29-31
    2.2.4 抗性植株分子生物学检测  31-36
3 结果与分析  36-46
  3.1 pDT-hrpZ 表达载体的构建  36-37
  3.2 大豆再生体系的建立  37-39
    3.2.1 不同基因型对大豆体细胞胚诱导的影响  37-38
    3.2.2 优异基因型品种胚胎发生的特点  38-39
  3.3 基因枪介导的遗传转化  39-41
  3.4 转基因植株分子生物学检测  41-46
    3.4.1 T0代转基因植株的 PCR 检测  41-42
    3.4.2 转基因大豆及对照总 RNA 的提取  42-43
    3.4.3 T0代转基因植株 hrpZ 表达量的 real-time PCR 检测  43-46
4 讨论  46-48
  4.1 大豆未成熟子叶体细胞胚诱导的主要影响因素  46-47
  4.2 基因枪轰击大豆体细胞胚的影响因素  47
  4.3 标记基因选择  47
  4.4 液体筛选优点  47
  4.5 下一步工作展望  47-48
5 结论  48-49
  5.1 构建了含 hrpZ 基因植物表达载体  48
  5.2 筛选出体细胞胚分化率较高的基因型大豆  48
  5.3 获得了转 HrpZ 基因大豆植株  48-49
致谢  49-50
参考文献  50-61
攻读硕士学位期间发表的学术论文  61

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 经济作物 > 油料作物 > 大豆
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