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Vel-FG人工融合基因的构建和转化拟南芥研究

作　者: 朱虹润
导　师: 马鸿翔
学　校: 南京农业大学
专　业: 作物遗传与育种
关键词: 小麦 Ve1-FG Western杂交 拟南芥转化
分类号: S512.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


小麦是世界性的粮食作物,全世界至少有35%的人口是以小麦为主要粮食的。小麦赤霉病是一种世界潮湿和半潮湿地区广泛发生的一种重要流行性病害。该病害不仅造成减产和品质降低,致病菌所产生的赤霉菌毒素还会污染小麦病粒,严重影响食品安全和人畜健康。抗赤霉病育种仍是控制小麦赤霉病的主要途径。但小麦抗赤霉病育种仍然面临着种质资源相对匮乏、抗病品种农艺性状欠佳及育种周期漫长等困难。通过植物基因工程可有针对性的将抗病相关基因导入感病品种中改良其抗病性,转基因工程株可以在保持原有受体品种的农艺性状的基础上提高抗病性。因此,本研究试图利用野生番茄上的抗黄萎病基因（Ve1）和小麦赤霉病的病原菌自身识别基因进行人工重组,并通过诱导表达和Western杂交,以验证人工重组基因是否正确表达,为后续在植物体内测试重组基因的功能奠定基础,探索抗病新策略。取得以下主要研究结果：根据在番茄上已经克隆到的抗黄萎病基因（Ve1）的序列,进行结构域分析,推测Vel基因1525-1820nt为抗病识别区域；该识别区域与所抗目标病害黄萎病原菌基因组识别蛋白基因VDBG-096011465-1755nt区间,一致性为21%（61%为阳性）。小麦赤霉病原菌基因组内存在与VDBG-09601同源的基因FGSG08285,一致性达55%（阳性率69%）,但在上述识别区域内无相似性。本研究通过融合Vel基因及FGSG08285基因,以期实现改造后的Vel基因能够识别小麦赤霉病菌从而达到抗病的全新策略。为了构建该融合基因,扩增出Vel基因1-1524nt和1821-3159nt两个片段以及小麦赤霉病FGSG08285基因1561-1857nt片段,三个片段大小分别为1524bp,1338bp,297bp.通过Fusion PCR方法构建Vel-FGSG08285（简称Ve1-FG）融合基因,全长为3159bp。经融合蛋白诱导表达及Western杂交,结果表明该融合基因与非融合Vel基因一致,具有表达活性,为可溶性蛋白,表达产物大小为117KDa,为后续基因抗病功能测试奠定基础。利用半定量RT-PCR对该基因的组织表达特异性进行分析,表明Ve1-FG在根和茎中表达量较高,在叶中和果实中表达量较低。构建植物表达载体pCXSN-Ve1-FG,利用农杆菌花序侵染法转化模式植物拟南芥；通过潮霉素抗性、PCR及RT-PCR筛选鉴定拟南芥植株,初步证明外源基因已经整合到拟南芥基因组中。对转基因拟南芥苗进行抗病性分析,结果显示转基因拟南芥对禾谷镰刀菌的抗病性比对照植株强。转基因拟南芥苗和对照在病原菌的诱导下,对病原菌的表达量变化进行分析,结果显示病原菌在转基因植株中比对照的表达量要低。

全文目录


摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
第一章 文献综述  10-22
  1 小麦抗赤霉病的研究进展  10-16
    1.1 小麦赤霉病的发生与危害  10
    1.2 小麦赤霉病的致病研究进展  10-13
    1.3 小麦赤霉病的抗性机制研究  13-16
  2 番茄上抗黄萎病基因Ve的研究进展  16-19
    2.1 番茄黄萎病的发生与危害  16-17
    2.2 番茄黄萎病病原菌生物学特性及形态特征  17
    2.3 番茄黄萎病病原菌致病力及抗病机制  17-18
    2.4 番茄黄萎病抗性遗传研究  18-19
  3 本研究的目的和意义  19-22
第二章 Vel-FG人工融合基因的构建及Western杂交  22-34
  1 材料与方法  22-27
    1.1 实验材料及试剂  22
    1.2 实验方法  22-27
  2 结果与分析  27-30
    2.1 Vel基因的蛋白结构域分析  27
    2.2 Vel在小麦基因组中的同源基因序列分析  27-28
    2.3 Vel基因的两个片段扩增  28
    2.4 基因FGSG_08285的片段扩增  28-29
    2.5 人工融合基因Vel-FG全长的扩增  29
    2.6 Vel-FG融合蛋白的诱导表达及Western杂交  29-30
  3 讨论  30-34
第三章 Vel-FG的拟南芥转化与功能分析  34-48
  1 材料与方法  34-41
    1.1 实验材料  34-35
    1.2 方法  35-41
  2 结果与分析  41-45
    2.1 植物表达载体pCXSN-Vel-FG的构建  41-42
    2.2 含有表达载体的农杆菌PCR检测  42
    2.3 拟南芥转Vel-FG基因阳性苗的获得  42-43
    2.4 转基因阳性植株的鉴定  43-44
    2.5 转基因拟南芥的抗病性分析  44
    2.6 转基因植株中Vel-FG基因的组织表达分析  44-45
    2.7 转基因拟南芥和对照在病原菌诱导下的病原菌表达量变化  45
  3 讨论  45-48
全文结论  48-50
参考文献  50-56
附录  56-58
致谢  58

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 禾谷类作物 > 麦 > 小麦
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