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小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因家族的分子鉴定与生理功能研究

作　者: 黄舒
导　师: 陈凡国
学　校: 山东大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 小麦甲硫氨酸亚砜还原酶分子鉴定生理功能非生物胁迫抗性
分类号: S512.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

在正常的有氧代谢、应对各种环境胁迫以及病菌侵害时细胞中会产生活性氧(ROS),可以对DNA,蛋白质和脂类等生物大分子造成不利影响并可能最终导致细胞的氧化损伤。尽管大部分生物在进化过程中形成了酶和非酶清除系统来清除ROS,但仍有部分ROS能够逃脱清除,导致生物大分子的氧化。蛋白质中的许多氨基酸残基,尤其是含硫氨基酸——半胱氨酸(Cys)和甲硫氨酸(Met)非常易于被ROS氧化。ROS介导的氧化会使Met形成S-和R-两种差向异构体的甲硫氨酸亚砜(MetSO),导致许多蛋白的活性和结构的改变,然而这种改变可以被甲硫氨酸亚砜还原酶(MSR)逆转。MSR主要有两种类型,MSRA和MSRB,分别特异性作用于S-和R-型MetSO异构体。MSRA和MSRB已经在包括细菌、酵母、哺乳动物和植物等在内的大部分生物有机体中得到了鉴定。植物中存在庞大的MSR基因家族,例如,在拟南芥中存在5个MSRA和9个MSRB同源基因,在水稻中也至少存在4个MSRA和3个MSRB。基因的多拷贝及具有不同的亚细胞定位使MSR在植物中可能起到了更多更复杂的作用。小麦是世界上最重要的粮食作物之一,其生长和产量受到干旱、盐碱、极端温度等多种非生物胁迫的严重影响,因此提高小麦的耐逆性是提高其产量的一个重要途径。本实验室利用不对称体细胞杂交创制渐渗系新技术,获得了普通小麦济南177(JN177)与近缘属长穗偃麦草(Ae)的小麦渐渗系耐盐新品种山融3号(SR3),并利用抑制性差减杂交技术(suppressive subtractive hybridization, SSH)技术构建了山融3号和济南177盐胁迫响应的SSH cDNA文库,为挖掘小麦的耐逆基因提供了平台。MSR在植物耐逆方面的研究已经在拟南芥及水稻中开展,但是对于小麦中MSR的研究至今未见报道。本论文首先利用拟南芥和水稻的MSR基因对NCBI网站上已经发布的小麦全长cDNA序列进行Blast分析,初步搜索找到了8个小麦同源基因。对这8个基因序列编码的蛋白产物在生物信息学方面进行了详细的分析,发现其中一个与AtMSRA4高度同源,具有MSRA的保守结构域因此命名为TaMSRA4,其余7个与AtMSRB同源,具有MSRB的保守结构域,并分属于3个不同的亚家族,分别为TaMSRBl亚家族,包括TaMSRBl.1和TaMSRBl.2, TaMSRB2亚家族,包括TaMSRB2.1、TaMSRB2.2和TaMSRB2.3,以及TaMSRB3亚家族,包括TaMSRB3.1和TaMSRB3.2。它们与同源的拟南芥和水稻的MSR在保守结构域中有着高度的相似性,并且同一亚家族成员间的序列是高度保守的,有的只有几个氨基酸的差别。软件预测它们编码的蛋白质有两种亚细胞定位方式,TaMSRB2亚家族成员定位在胞质中,而TaMSRA4,TaMSRBl亚家族和TaMSRB3亚家族成员均定位在叶绿体中,这一结果与它们的同源AtMSR存在个别差异。为了探索小麦MSR基因在抗逆方面的功能,本论文选择了两个分属于不同亚家族的基因TaMSRB2.1和TaMSRB3.1进行了深入的研究,其中TaMSRB2.1在本实验室的山融3号和亲本JN177在NaCl和PEG胁迫下基因差异表达的芯片结果中还表现出了转录水平的显著变化。RT-PCR分析结果表明在NaC1、PEG处理下两个基因均出现了短暂上调表达的趋势,两个基因在不同组织器官中的表达模式也存在差异。从山融3号全长cDNA文库中对这两个基因进行了克隆,亚细胞定位实验表明它们的实际定位结果与软件预测一致。分别构建两个基因的过表达载体并转化模式植物拟南芥,之后进行了多种处理下的拟南芥根长表型实验,研究发现过表达TaMSRB2.1的转基因株系在NaCl和甘露醇处理下与野生型相比表现出了明显的根长优势,说明TaMSRB2.1的过表达增强了拟南芥对盐、旱的耐受性,而在H202和ABA等处理下转基因株系与野生型生长状况无明显差异；TaMSRB3.1的过表达株系在NaC1、H2O2、ABA以及高浓度的甘露醇处理下根长优势表现显著,在控水实验中,过表达TaMSRB3.1使拟南芥的存活率提高。研究结果表明了TaMSRB2.1和TaMSRB3.1的过表达增强了拟南芥对多种非生物胁迫的抗性。本研究初步证明了部分小麦MSR在耐逆方面的功能,同时也可能用于今后的作物育种中。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-11
符号说明  11-12
第一章文献综述  12-29
  引言  12
  1 逆境胁迫与植物体内活性氧的积累  12-15
    1.1 逆境胁迫类型  12-13
    1.2 活性氧对植物的影响  13-14
    1.3 植物体内的活性氧清除系统  14-15
  2 甲硫氨酸亚砜还原酶(MSR)  15-23
    2.1 蛋白质中Met的氧化与还原  15-16
    2.2 MSR的类型及亚群  16-19
    2.3 MSR的催化机制  19-21
    2.4 植物中的MSR  21-23
  3 MSR的生理作用  23-26
    3.1 MSR在动物中的病理生理作用  23-24
    3.2 MSR在植物中的生理作用  24-26
  4 对MSR的研究展望  26-27
  5 本论文的目的、意义和主要研究内容  27-29
第二章小麦MSR基因家族的生物信息学鉴定  29-40
  1 材料与方法  29
    1.1 小麦MSR同源基因的搜索  29
    1.2 蛋白质性质的分析  29
  2 结果  29-37
    2.1 小麦MSR基因家族的组成  29-31
    2.2 TaMSR的序列分析  31-35
    2.3 蛋白保守结构域及三级结构预测  35-36
    2.4 小麦中MSR的基本特性和亚细胞定位预测  36-37
  3 讨论  37-40
第三章小麦MSR基因家族的功能分析  40-64
  1 实验材料和试剂  40-42
    1.1 植物材料  40
    1.2 菌株和载体材料  40
    1.3 成品试剂及药品  40-41
    1.4 培养基和溶液  41-42
  2 实验方法  42-49
    2.1 盐、旱胁迫下TaMSRB2.1和TaMSRB3.1的表达模式分析  42-44
    2.2 TaMSRB2.1、TaMSRB3.1的组织表达模式分析  44
    2.3 TaMSRB2.1、TaMSRB3.1的克隆  44-45
    2.4 亚细胞定位研究分析  45-47
    2.5 转基因拟南芥的获取及研究  47-49
  3 结果与分析  49-60
    3.1 TaMSRB2.1、TaMSRB3.1的表达模式分析  49-50
    3.2 TaMSRB2.1、TaMSRB3.1基因的克隆  50-52
    3.3 TaMSRB2.1、TaMSRB3.1的亚细胞定位研究  52-53
    3.4 拟南芥过表达植株的获得  53-56
    3.5 拟南芥过表达株系表型分析  56-60
  4 讨论  60-64
参考文献  64-70
致谢  70-71
附件  71

小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因家族的分子鉴定与生理功能研究

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