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基因枪法介导拟南芥AtMYB44基因转化小麦的研究

作　者: 郑博
导　师: 张萍萍
学　校: 安徽大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 普通小麦 基因枪法 AtMYB44基因 转基因植株 分子检测
分类号: S512.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


普通小麦(Triticum aestivum L.)是禾谷类家族中最为重要的成员之一,是全球总产量最多、种植面积最广的粮食作物。在世界粮食问题日趋严重的今天,提高小麦的产量和品质对缓解粮食短缺问题具有重要的实际意义。目前,利用基因工程技术的手段对小麦进行遗传改良,提高小麦的产量、改善小麦的品质、增强小麦对病虫害以及各种非生物胁迫的抵抗性,是小麦遗传育种中十分重要的发展方向。基因枪法是小麦遗传转化中最为广泛使用的一种方法,它具有无宿主限制、靶受体类型广泛、可控度高、操作简便快捷等优点。本研究采用基因枪转化法,将具有抗旱、抗寒及耐盐功能的拟南芥AtMYB44基因转入小麦品种扬麦158中,主要研究结果如下：1.建立并优化了扬麦158的高效再生体系。通过添加2,4-D浓度的梯度实验,发现在诱导培养基中添加2,4-D的浓度为2mg·L-1时,小麦幼胚的愈伤出愈率为最高的100%,且诱导出的愈伤组织较为致密,颜色为淡黄色,长势旺盛。通过添加不同浓度KT、IAA配比的比较实验,发现在分化培养基中激素添加为KT1.0mg.L-1和IAA0.5mg.L-1时,愈伤组织的分化率为最高的93.3%,且绿点数及丛生芽数都相比较高。最终确定本研究中愈伤诱导培养基为MS+2mg/L2,4-D;分化培养基为MS+1.0mg/L KT+0.5mg/L IAA。2.利用绿色荧光蛋白基因(GFP)作为标记基因,对基因枪的主要参数(轰击距离和钨粉/DNA用量)进行了优化。结果表明轰击距离为8cm时,GFP的瞬时表达率为最高的37.1%,且平均荧光细胞数也为最多的13.5个；钨粉/DNA用量为600μg/1μg时,GFP的瞬时表达率为最高的35.4%,且平均荧光细胞数也为最多的12.8个。最终确定了针对扬麦158幼胚愈伤组织的基因枪转化最佳轰击条件：轰击距离为8cm,钨粉/DNA的用量为600μg/1μg,氦气压力为7.5MPa,破裂膜为7MPa,真空度为0.095MPa,钨粉直径1μm。3.用基因枪法将拟南芥的AtMYB44基因导入到扬麦158中,获得了转基因植株,目的基因转化率为0.67%。本研究中共轰击了1044块愈伤组织,经过分化培养产生绿点的愈伤组织数为314块,经过生根壮苗培养,再生植株数为297株,其分化率和成苗率为分别为30.1%和28.4%；经过炼苗,越夏处理,将再生植株全部移栽到实验田中,最终成活了198株再生植株(To),其移栽成活率为66%。提取再生植株的基因组DNA,分别对目的基因AtMYB44和选择标记基因Bar进行PCR检测,发现有7株再生植株的PCR检测结果呈阳性,并将目的基因AtMYB44的PCR产物片段进行克隆测序,结果比对正确,最终获得了7株转基因小麦植株。4.对转基因小麦其中一个株系M-141的7株T1代植株进行了PCR检测,结果显示7株均扩增出预期大小的DNA条带。本研究通过基因枪法将目的基因转入到小麦品种扬麦158的愈伤组织,经抗性筛选、分化再生得到再生植株,对再生植株(To)和转基因植株的后代(T1)用PCR方法进行了鉴定,结果表明已获得转AtMYB44基因的小麦植株,为进一步对AtMYB44基因在小麦中的功能表达、转基因小麦的抗逆性等研究奠定了基础。通过进一步的田间遗传稳定性、田间抗性等研究,从中筛选出具有较强抗旱、抗寒和耐盐碱的转基因植株,对小麦的南麦北种、提高盐碱滩涂耕地的利用率,以及提高小麦的总产量将具有重要的意义。

全文目录


摘要  3-5
Abstract  5-8
目录  8-10
缩略词表  10-11
第一部分 文献综述  11-31
  第一章 小麦转基因技术研究进展  11-22
    1 小麦转基因技术研究概况  12-13
    2 小麦遗传转化受体系统的建立  13-14
    3 小麦遗传转化的主要方法  14-22
      3.1 基因枪法  15-18
      3.2 根癌农杆菌介导法  18-19
      3.3 花粉管通道法  19-20
      3.4 低能离子束介导法  20
      3.5 电激转化法和PEG转化法  20-22
  第二章 MYB类转录因子的研究就进展  22-31
    1 MYB转录因子的结构特征与分析  22-24
    2 MYB转录因子的生物学功能  24-29
    3 MYB类转录因子的自身调控  29-30
    4 AtMYB44基因的研究进展  30
    5 本文研究的目的及意义  30-31
第二部分 研究报告  31-63
  第一章 扬麦158组织培养体系及其基因枪转化条件的优化  31-41
    1 材料与方法  32-35
      1.1 实验材料  32-33
      1.2 实验设计  33
      1.3 实验方法  33-35
    2 结果与分析  35-40
      2.1 不同处理对扬麦158愈伤组织诱导的影响  35-36
      2.2 不同处理对扬麦158愈伤组织分化再生的影响  36-38
      2.3 不同轰击距离对GFP瞬时表达的影响  38
      2.4 不同钨粉/DNA用量对GFP瞬时表达的影响  38-40
    3 讨论  40-41
  第二章 小麦转拟南芥AtMYB-44基因的遗传转化研究  41-63
    1 材料与方法  41-52
      1.1 实验材料  41-44
      1.2 实验方法  44-52
    2 结果与分析  52-62
      2.1 小麦愈伤组织Bialahpos的敏感性实验  52-53
      2.2 AtMYB44基因的遗传转化  53-57
      2.3 T_0代转基因植株的分子鉴定  57-60
      2.4 T_1代转基因植株的PCR检测  60-62
    3 讨论  62-63
全文结论  63-65
附录  65-66
参考文献  66-77
攻读硕士学位期间发表的论文  77-78
致谢  78

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 禾谷类作物 > 麦 > 小麦
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