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抗草甘膦真菌的分离及EPSPS基因克隆与表达研究

作　者: 于海涛
导　师: 陶波
学　校: 东北农业大学
专　业: 农药学
关键词: 草甘膦 EPSPS 18S rRNA 鉴定 假丝酵母菌 cDNA文库
分类号: S482.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


草甘膦是一种高效、低毒、广谱、内吸的非选择性灭生除草剂。它于1974年在美国被注册登记,是全世界除草剂消费量最大的品种之一。草甘膦能防除绝大多数一年生及多年生杂草,但由于其非选择性,在杀死杂草的同时对农作物也具有毒害作用。而提高作物对草甘膦的抗性,有利于草甘膦在农业生产中的应用并降低生产成本。因此,抗除草剂基因的发掘与利用己成为当今生物基因工程领域研究的重点。从抗除草剂微生物中分离抗性基因是最主要的途径。从受除草剂极端污染的土壤中筛选抗除草剂菌株是一种有效的方法。本研究从生产草甘膦工厂排污口的污泥中筛选到一株高抗草甘膦的真菌,并对其进行了形态学鉴定、生理生化特性测定及18S rRNA分子鉴定。利用SMARTer技术构建了菌株的全长cDNA文库。以抗草甘膦菌株假丝酵母菌TY-JM(Candida palmioleophila)和黄曲霉TZ1985(Aspergillus flavus)为材料,首次从假丝酵母与黄曲霉中分离得到EPSPS基因,并将其转化大肠杆菌验证其具有抗草甘膦功能,国内外未见报道。期望能为转基因抗除草剂作物新品种的培育提供新的基因资源。主要研究结果如下：1.利用瓶培养富集技术,从生产草甘膦工厂排污口的污泥中筛选到一株抗草甘膦浓度高达900mmol/L的真菌,命名为TY-JM。结合形态学观察、生理生化特性及18S rRNA序列分析,TY-JM被鉴定为假丝酵母菌Candida palmioleophila.形态学特征和生理生化特性与前人研究结果一致,18S rRNA系统进化分析表明其与假丝酵母同源性高达99%,序列上传至GenBank登录号为JN656713。2.以菌株TY-JM总RNA为模板,利用Clontech公司CreatorTM SMARTTM cDNA Library Construction Kit构建了TY-JM的cDNA文库,并对文库质量进行了鉴定。原始文库滴度为2.58×106cfu/ml,文库库容为2.58×106cfu,扩增后滴度为3.42×109cfu/ml,重组率97.6%,文库插入片段范围为500bp-3kb,主要集中在1kb附近,说明该文库cDNA片段的序列比较完整,文库质量符合标准。3.通过比较基因组学的方法,分离得到了假丝酵母TY-JM和黄曲霉TZ1985的EPSPS蛋白编码序列。编码序列长度分别为1311bp和1353bp,分别编码436个氨基酸和450个氨基酸,理论分子量分别为46kDa和48kDa,等电点分别为5.77和6.04。TY-EPSPS(TY-JM的EPSPS)和TZ-EPSPS(TZ1985的EPSPS)基因推导的氨基酸序列经NCBI Protein BLAST程序分析表明,TY-EPSPS基因与热带假丝酵母、杜氏假丝酵母和白假丝酵母等具有80%的序列一致性；与核盘菌、棒曲霉具有66%的序列一致性,TZ-EPSPS基因与烟曲霉、棒曲霉、黑曲霉、白曲霉和土曲霉具有90%的序列一致性；与杜氏假丝酵母、白假丝酵母和热带假丝酵母具有68%的序列一致性。采用MIEGA4.0软件分析TY-EPSPS和TZ-EPSPS基因与其它种的EPSPS的进化关系,结果表明,TY-EPSPS和TZ-EPSPS均与真菌的EPSPS亲缘关系较近,而与植物和细菌的(?)PSPS亲缘关系较远。其中TY-EPSPS与酵母属亲缘关系最近,TZ-EPSPS与曲霉属的亲缘关系最近。4.将TY-EPSPS和T.Z-EPSPS连接pET-30a载体后转入大肠杆菌BL21(DE3)后,使大肠杆菌对草甘膦的抗性从原来的50mmol/L提高到了75mmol/L,高于空质粒阴性对照。说明重组质粒转化大肠杆菌后在其体内成功进行复制表达,提高了大肠杆菌对草甘膦的抗性。

全文目录


摘要  10-12
Abstract  12-14
1 前言  14-27
  1.1 草甘膦生产及发展  14
  1.2 草甘膦性质及作用机理  14-18
    1.2.1 草甘膦结构及理化性质  14-15
    1.2.2 草甘膦的优缺点  15-17
    1.2.3 草甘膦作用机制  17-18
  1.3 草甘膦抗性来源  18-20
  1.4 EPSPS研究进展  20-23
    1.4.1 EPSP合酶分类  20
    1.4.2 EPSP合酶的定位和转运肽  20-21
    1.4.3 EPSP合酶的高级结构与活性区  21-22
    1.4.4 EPSPS基因研究  22-23
  1.5 抗草甘膦转基因作物的发展  23-25
  1.6 本研究目的与意义  25-26
  1.7 本研究技术路线  26-27
2 材料与方法  27-44
  2.1 实验材料  27-29
    2.1.1 供试菌种与载体  27
    2.1.2 供试除草剂  27
    2.1.3 供试培养基  27
    2.1.4 常用试剂配制方法  27-28
    2.1.5 试剂盒、酶及其它试剂耗材  28
    2.1.6 引物  28
    2.1.7 主要仪器设备  28-29
  2.2 菌株TY-JM的分离鉴定及系统发育树研究  29-32
    2.2.1 菌株TY-JM的富集、分离与纯化  29
    2.2.2 菌株TY-JM的形态学研究  29-30
    2.2.3 菌株TY-JM的生理生化特性测定  30
    2.2.4 18S rRNA的PCR扩增和序列测定  30-32
    2.2.5 系统发育树的构建  32
  2.3 菌株TY-JM的cDNA文库构建  32-36
    2.3.1 TY-JM总RNA的提取  32-33
    2.3.2 菌株全长cDNA文库的构建及文库质量鉴定  33-36
  2.4 菌株TY-JM的EPSPS基因克隆  36-37
    2.4.1 引物设计  36
    2.4.2 PCR扩增EPSPS基因片段  36
    2.4.3 目的片段回收  36-37
    2.4.4 连接载体  37
    2.4.5 转化及克隆检测  37
    2.4.6 测序  37
    2.4.7 生物信息学分析  37
  2.5 菌株TZ1985的EPSPS基因克隆  37-40
    2.5.1 基因组DNA的提取  37-38
    2.5.2 菌株TZ1985的AROM基因DNA片段分离  38-39
    2.5.3 菌株TZ1985的EPSPS基因片段分离  39-40
  2.6 EPSPS基因的原核表达研究  40-44
    2.6.1 制备带酶切位点的EPSPS基因片段  40-42
    2.6.2 制备载体  42
    2.6.3 连接重组质粒  42
    2.6.4 重组质粒的测序验证  42
    2.6.5 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达  42-43
    2.6.6 重组大肠杆菌草甘膦抗性的鉴定  43-44
3 结果与分析  44-64
  3.1 抗草甘膦菌株TY-JM的分离鉴定  44-47
    3.1.1 菌株的分离  44
    3.1.2 菌株的形态学特征  44-45
    3.1.3 菌株的生理生化特性  45
    3.1.4 18S rRNA序列分析  45-47
    3.1.5 基于18S rRNA序列的系统发育树构建  47
  3.2 菌株TY-JM的cDNA文库构建  47-50
    3.2.1 TY-JM总RNA质量分析  47-48
    3.2.2 合成ds cDNA的PCR最佳循环数的确定  48-49
    3.2.3 cDNA片段化分级分离  49
    3.2.4 文库质量鉴定  49-50
  3.3 菌株TY-JM的EPSPS基因克隆  50-52
  3.4 菌株TZ1985的AROM基因同源序列的确定  52
  3.5 TZ1985的AROM基因DNA片段扩增  52-55
  3.6 菌株TZ1985的EPSPS基因克隆  55-57
  3.7 EPSPS基因序列分析  57-59
  3.8 EPSPS基因原核表达研究  59-64
    3.8.1 制备带酶切位点的基因片段  59-60
    3.8.2 原核表达载体构建  60
    3.8.3 转化大肠杆菌及阳性克隆子检测  60-61
    3.8.4 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达  61-62
    3.8.5 重组大肠杆菌草甘膦抗性的鉴定  62-64
4 讨论  64-67
  4.1 抗草甘膦菌株TY-JM的分离鉴定  64
  4.2 cDNA文库构建及文库质量鉴定  64-65
  4.3 EPSPS基因的克隆与表达研究  65
  4.4 EPSPS基因的进一步研究  65-67
5 结论  67-68
  5.1 菌株TY-JM鉴定为假丝酵母菌  67
  5.2 成功构建了菌株TY-JM的cDNA文库  67
  5.3 EPSPS基因的克隆与序列分析  67
  5.4 TY-EPSPS和TZ-EPSPS具有抗草甘膦功能  67-68
致谢  68-69
参考文献  69-75
攻读硕士学位期间发表的学术论文  75

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 农药防治（化学防治） > 各种农药 > 除草剂（杀草剂）
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