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基于微管蛋白靶标的几种蔬菜主要病原真菌耐药性与抗药性机理的研究

作　者: 黄大野
导　师: 李宝聚
学　校: 沈阳农业大学
专　业: 农药学
关键词: β-微管蛋白耐药性抗药性多菌灵乙霉威
分类号: S482.2
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

多菌灵和乙霉威是生产上防治多种作物病害的重要杀菌剂,作用靶标均为β-微管蛋白。多菌灵是一种广谱杀菌剂,对子囊菌、多数半知菌有活性,但对鞭毛菌和少数半知菌无效,即这些真菌对其具有耐药性。随着多菌灵的广泛使用,多种作物病害的病原菌对其产生抗药性；乙霉威作为负交互抗药性杀菌剂用于多菌灵抗性菌株的治理。本研究一方面以多主棒孢菌(Corynespora cassiicola)等几种多菌灵耐药性真菌为研究对象,对其β-微管蛋白基因进行克隆及氨基酸序列分析,探究其耐药性分子机理；另一方面多主棒孢菌(Corynespora cassiicola)为对象,对其多菌灵和乙霉威的抗药性进行了系统研究,重要研究结果如下：1.β-微管蛋白167位氨基酸突变为酪氨酸可能与植物病原真菌对多菌灵的耐药性有关。(1)明确了链格孢属3个种、匍柄霉属2个种和两种卵菌对多菌灵具有耐药性。通过测定20个属23种蔬菜和花卉病害病原菌对多菌灵敏感性,发现多菌灵浓度为1μg/ml,对灰葡萄孢(Botrytis cinerea)菌丝生长抑制率已达100%；多菌灵浓度为100μg/ml,对瓜链格孢(Alternaria.cucumerina)、茄链格孢(Alternaria.solani)、链格孢(Alternaria. alternata)、茄匍柄霉(Stemphylium solani),菠菜匍柄霉(Stemphylium spinaciae)辣椒疫霉(Phytophthora. capsici)和德巴利腐霉(Pythium. debaryanum)菌丝生长仍无明显抑制效果,表明上述7种真菌为多菌灵耐药性真菌。(2)初步明确了β-微管蛋白167位氨基酸突变为酪氨酸是链格孢属3个种、匍柄霉属2个种和两种卵菌对多菌灵具有耐药性的重要原因。对链格孢属3个种瓜链格孢、茄链格孢和链格孢,匍柄霉属2个种茄匍柄霉和菠菜匍柄霉,2种卵菌辣椒疫霉和德巴利腐霉β-微管蛋白基因进行了克隆并对其氨基酸序列进行分析,其β-微管蛋白167位氨基酸均为酪氨酸(Tyr),而其他对多菌灵敏感的真菌167位均为苯丙氨酸(Phe)。据此推测植物病原真菌β-微管蛋白167位氨基酸由苯丙氨酸(Phe)突变为酪氨酸是对多菌灵产生抗药性的原因。2.明确了我国多主棒孢菌对多菌灵和乙霉威抗性频率、抗性菌株适合度、交互抗药性及其对多菌灵和乙霉威抗药性分子机制。(1)我国多主棒孢菌对多菌灵抗性频率极高,而对多菌灵和乙霉威双抗频率较低。对采自我国12个地区,18个寄主的163株多主棒孢菌对多菌灵和乙霉威的敏感性进行分析,145个菌株对多菌灵具有抗药性,抗性频率高达89.0%,18个菌株对多菌灵敏感,占供试菌株的11.0%。24个菌株对多菌灵和乙霉威具有双重抗药性,双抗频率为14.7%。(2)多菌灵高抗(MBCHR)和多菌灵乙霉威双抗(MBCHRNPCR)菌株的适合度无明显下降。野生菌株(MBCS)菌落直径为55.17mm和50.83mm,产孢量为1.78×105个/ml和2.50×105个/ml,病指为79.80和83.37,多菌灵高抗(MBCHR)和多菌灵乙霉威双抗(MBCHRNPCR)菌株菌落直径在50.17mm-59.83mm之间,产孢量在1.89个/ml-2.94×105个/ml之间,病指在81.33-89.29之间。三种敏感性类型菌株菌丝生长速率、产孢量和致病力并无明显的差别。(3)多菌灵高抗(MBCHR)和多菌灵乙霉威双抗(MBCHRNPCR)菌株与其它5种类型杀菌剂无交互抗药性。烟酰胺类杀菌剂啶酰菌胺对多主棒孢菌两个野生菌(MBCS)的EC50分别为0.49μg/ml和0.651μg/ml,而对于高抗(MBCHR)和双抗(MBCHRNPCR)菌株EC50在0.36μg/ml-0.71μg/ml之间。苯基吡咯类杀菌剂咯菌腈对多主棒孢菌两个野生菌株(MBCS)的EC50分别为0.26μg/ml和0.20μg/ml,而对于高抗(MBCHR)和双抗(MBCHRNPCR)菌株EC50在0.15μg/ml-0.27μg/ml之间。咪唑类杀菌剂咪鲜胺对多主棒孢菌两个野生菌株(MBCS)的EC50分别为0.14μg/ml和0.191μg/ml,而对于高抗(MBCHR)和双抗菌株(MBCHRNPCR) EC50在0.14μg/ml-0.26μg/ml之间。嘧啶胺杀菌剂嘧菌环胺对多主棒孢菌两个野生菌株(MBCS)的EC50分别为0.7μg/ml和0.75μg/ml,而对于高抗(MBCHR)和双抗(MBCR)菌株EC50在0.67-0.83μg/ml之间。二甲酰亚胺类杀菌剂腐霉利对多主棒孢菌两个野生菌株(MBCS)的EC50分别为0.45μg/ml和0.37μg/ml,而对于高抗(MBCHR)和双抗(MBCHRNPCR)菌株EC50在0.37μg/ml-0.50μg/ml之间。(4)明确了多主棒孢菌对多菌灵抗药性和多菌灵乙霉威双重抗药性分子机制。通过比较多主棒孢菌敏感、多菌灵高抗(MBCHR)和多菌灵乙霉威双抗(MBCHRNPCR)菌株β-微管蛋白序列,发现198位氨基酸由谷氨酸(Glu)突变为丙氨酸(Ala)是导致其对多菌灵产生高等抗药性的原因。198位氨基酸由谷氨酸突变为赖氨酸(Lys),200位氨基酸由苯丙氨酸(Phe)突变为酪氨酸(Tyr)是其对多菌灵和乙霉威产生双重抗药性的原因。本研究首次提出植物病原真菌β-微管蛋白167位氨基酸的种类可能与多菌灵对不同属植物病原真菌敏感性有关,从分子水平解释了多菌灵对不同属植物病原真菌的敏感性,为进一步开发基于p-微管蛋白的新型杀菌剂和筛选模型奠定基础；此外,在我国首次报道了多主棒孢菌多菌灵高抗(MBCHR)和多菌灵乙霉威双抗(MBCHRNPCR)菌株及其抗药性的分子机理,上述结果将为我国多主棒孢菌的化学防治,抗性菌株的分子检测等提供有用的信息。

全文目录

摘要  9-11
Abstract  11-13
第一章文献综述  13-31
  1.1 植物病原菌耐药性与抗药性的概念  13
  1.2 植物病原菌耐药性研究进展  13-14
  1.3 植物病原菌抗药性研究进展  14-18
    1.3.1 苯并咪唑类杀菌剂  15
    1.3.2 二甲酰亚胺类杀菌剂  15-16
    1.3.3 麦角甾醇抑制剂  16
    1.3.4 苯基酰胺类杀菌剂  16-17
    1.3.5 甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂  17-18
    1.3.6 植物病原菌抗药性监测与抗性菌的治理  18
  1.4 微管蛋白的结构功能  18-23
    1.4.1 微管蛋白的结构  18-21
    1.4.2 微管蛋白的功能  21-23
  1.5 微管蛋白杀菌剂研究进展  23-27
    1.5.1 苯并咪唑类杀菌剂  23-26
    1.5.2 苯并咪唑类负交互抗药性杀菌剂  26-27
    1.5.3 苯酰菌胺  27
  1.6 多主棒孢菌的化学防治和抗药性研究进展  27-29
  1.7 研究目的与意义  29-31
第二章不同属蔬菜病原真菌对多菌灵的敏感性研究  31-40
  2.1 试验材料  31-32
  2.2 试验方法  32
  2.3 结果与分析  32-38
    2.3.1 植物病原真菌耐药性  32-33
    2.3.2 植物病原真菌抗药性  33-38
  2.4 小结与讨论  38-40
第三章几种蔬菜病原真菌对多菌灵耐药性机理的研究  40-61
  3.1 试验材料  40-42
  3.2 试验方法  42-45
    3.2.1 基因组DNA的提取  42
    3.2.2 聚合酶链式反应  42-44
    3.2.3 PCR产物的回收与纯化  44
    3.2.4 目的基因的连接与转化  44-45
    3.2.5 序列分析  45
  3.3 结果与分析  45-54
    3.3.1 多菌灵耐药性链格孢属真菌β-微管蛋白基因的克隆与序列分析  45-49
    3.3.2 多菌灵耐药性匍柄霉属真菌β-tubulin基因的克隆与序列分析  49-52
    3.3.3 多菌灵耐药性卵菌β-微管蛋白基因的克隆与序列分析  52-54
  3.4 小结与讨论  54-61
第四章多主棒孢菌对多菌灵和乙霉威的抗药性研究  61-87
  4.1 试验材料  61-62
  4.2 试验方法  62-65
    4.2.1 病原菌的分离  62-63
    4.2.2 多主棒孢菌对多菌灵和乙霉威敏感性测定  63
    4.2.3 多主棒孢菌抗性菌株的生物学特性  63-64
    4.2.4 抗性菌株交互抗药性研究  64-65
    4.2.5 多主棒孢菌基因组DNA的提取  65
    4.2.6 多主棒孢菌β-微管蛋白基因的克隆  65
    4.2.7 PCR产物的回收与纯化  65
    4.2.8 目的基因的连接与转化  65
  4.3 结果与分析  65-82
    4.3.1 我国多主棒孢菌对多菌灵和乙霉威敏感性  65-73
    4.3.2 多主棒孢菌不同敏感性类型菌株的生物学特性  73-75
    4.3.3 多主棒孢菌抗性菌株与其他杀菌剂的交互抗药性  75-78
    4.3.4 不同敏感性类型多主棒孢菌β-微管蛋白核苷酸和氨基酸序列分析  78-82
  4.4 小结与讨论  82-87
第五章结论与讨论  87-93
  5.1 全文结论  87-88
  5.2 讨论  88-92
  5.3 创新点  92-93
参考文献  93-104
附录  104-116
致谢  116-117
攻读学位期间发表论文情况  117

基于微管蛋白靶标的几种蔬菜主要病原真菌耐药性与抗药性机理的研究

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