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银杏内生细菌W5的分离鉴定及其定殖的初步研究

作　者: 黄未
导　师: 胡方平
学　校: 福建农林大学
专　业: 植物病理学
关键词: 银杏解淀粉链芽孢杆菌内生防病
分类号: S476.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 29次
引　用: 1次
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内容摘要

从南平顺昌种植地和福建农林大学校区内分离到的银杏内生细菌数量为1.0-25.2×103 cfu/(g.fw)。其中,从植株的不同部位上分析,银杏枝干分离到的内生细菌数量显著多于叶,从不同地区上分析,南平顺昌种植地分离到的银杏内生细菌数量显著高于福建农林大学校区。利用辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)、稻瘟病菌(PyricuLaria grisea)、水稻纹枯菌(Rhizotonia solani)、黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、荔枝霜疫霉菌(Peronophythora litchii)和荔枝酸腐菌(Geotrichum candidum)6种病原菌对所分离到的银杏内生细菌进行拮抗能力筛选,最终分离出9株拮抗菌,其中以菌株W5的拮抗能力最强,尤其是对辣椒疫霉菌,其抑菌带宽达9.0mm,抑菌率高达88.9%。实验通过形态学观察、生理生化测定和16S rDNA分析三方面对W5菌株进行鉴定,判断内生细菌W5为解淀粉链芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。辣椒采后果疫病防病试验的结果表明,菌株W5在接种后的2d-3d,对辣椒疫霉病菌的抑制作用最强,防治效果最明显。其中,先接W5菌株后接辣椒疫霉菌的防治效果最佳,在第2d时高达100.00%,先接辣椒疫霉菌后接W5菌株的防治效果最差,只有11.96%。同时,经过W5菌液处理的辣椒果,发病之后,绝大多数在果蒂处产生稀疏的白色菌丝,而且果实青绿坚挺,并不像未经过W5菌液处理的辣椒果那样,发病之后,从果蒂处往下,遍布浓密的白色菌丝,出现水渍状,部分组织发黄塌陷。W5菌内生定殖能力试验的结果表明,双重标记菌W5能稳定存在于银杏组织内,其种群数量在1.66×104 cfu/(g.fw)左右。前期,标记菌W5聚集在表皮细胞,并通过表皮及其气孔扩散到叶肉细胞,之后聚集在维管束周围,到后期,标记菌W5零星分散在维管束和细胞间隙处,并不进入细胞内。

全文目录

中文摘要  8-9
英文摘要  9-10
1 文献综述  10-16
  1.1 植物内生细菌的研究现状  10-13
    1.1.1 植物内生细菌的定义  10
    1.1.2 植物内生细菌的种类  10
    1.1.3 植物内生细菌的内生定殖  10-11
    1.1.4 植物内生细菌定殖的检测方法  11-12
    1.1.5 植物内生细菌的生物防治作用及其机制研究  12-13
  1.2 银杏相关活性物质研究现状  13-15
    1.2.1 银杏的起源  13
    1.2.2 我国银杏资源丰富  13
    1.2.3 国内外银杏相关活性物质研究概况  13-15
      1.2.3.1 银杏主要化学成分的研究概况  13-14
      1.2.3.2 银杏药理作用的研究概况  14
      1.2.3.3 银杏内生真菌的研究概况  14-15
  1.3 银杏内生细菌的研究展望  15-16
2 银杏内生细菌的分离筛选  16-23
  2.1 材料与方法  16-17
    2.1.1 实验材料  16
    2.1.2 供试病原菌  16
    2.1.3 培养基  16
    2.1.4 内生细菌分离方法  16
    2.1.5 拮抗菌株的筛选  16-17
  2.2 结果与分析  17-20
    2.2.1 银杏体内内生细菌的数量  17-18
    2.2.2 拮抗辣椒疫霉菌的内生细菌筛选  18-19
    2.2.3 菌株 W5 对其它植物病原真菌的拮抗能力  19-20
  2.3 小结与讨论  20-23
    2.3.1 环境对银杏内生细菌的影响  20-21
    2.3.2 银杏内生细菌的分离  21
    2.3.3 银杏抗菌内生细菌的分离  21-23
3 银杏内生细菌W5 的鉴定  23-40
  3.1 材料与方法  23-30
    3.1.1 标准（对照）菌株  23
    3.1.2 培养基  23
    3.1.3 染色剂和生理生化鉴定试剂  23
    3.1.4 分子生物学试剂  23-24
    3.1.5 鉴定方法  24-30
      3.1.5.1 菌体的形态观察  24
      3.1.5.2 生理生化测定  24-27
      3.1.5.3 16S rRNA 基因鉴定  27-30
  3.2 结果与分析  30-39
    3.2.1 菌株 W5 的菌体的形态  30
    3.2.2 理化性质研究  30-33
    3.2.3 16S rRNA 基因的克隆和序列测定  33-39
      3.2.3.1 W5 基因组 DNA 的提取(CTAB 法)  33
      3.2.3.2 16S rDNA 的 PCR 扩增  33-35
      3.2.3.3 目的条带序列测定  35-36
      3.2.3.4 菌株 W5 的16S rDNA 分析  36-39
  3.3 小结与讨论  39-40
    3.3.1 菌株 W5 基本特征  39
    3.3.2 菌株 W5 的种属鉴定  39-40
4 银杏内生解淀粉芽孢杆菌 W5 的生物学特性研究  40-45
  4.1 材料与方法  40-41
    4.1.1 供试菌  40
    4.1.2 培养基  40
    4.1.3 菌株 W5 的生长情况  40
      4.1.3.1 菌株 W5 在30℃下的生长情况  40
      4.1.3.2 菌株 W5 在30℃下的芽孢形成情况  40
    4.1.4 W5 菌株对辣椒疫霉病菌的影响  40-41
      4.1.4.1 W5 菌对辣椒疫霉菌菌丝生长的影响  40
      4.1.4.2 W5 菌株上清液对菌丝生长的影响  40-41
      4.1.4.3 W5 菌分泌物对菌丝生长的影响  41
  4.2 结果与分析  41-43
    4.2.1 菌株 W5 的生长情况  41-42
    4.2.2 W5 菌株对辣椒疫霉病菌生长的影响  42-43
  4.3 小结与讨论  43-45
5 银杏内生细菌 W5 对辣椒采后果疫病防病作用研究  45-50
  5.1 材料与方法  45-46
    5.1.1 供试菌株  45
    5.1.2 培养基及培养方法  45
    5.1.3 供试辣椒品种  45
    5.1.4 菌株 W5 防治辣椒采后果疫病  45-46
      5.1.4.1 不同的辣椒疫霉菌孢子浓度对辣椒采后果的致病力测定  45
      5.1.4.2 不同的间隔时间接种菌株 W5 和疫霉病菌的防治试验  45
      5.1.4.3 以TB2 作为对照，试验菌株 W5 对辣椒采后果疫病的防治效果  45-46
      5.1.4.4 辣椒果上疫病病情指数分级标准  46
  5.2 结果与分析  46-48
    5.2.1 不同的辣椒疫霉菌孢子浓度对辣椒采后果的致病力测定  46
    5.2.2 先后接种菌株 W5 和疫霉病菌的防治试验  46-47
    5.2.3 以 TB2 菌株作为对照，试验菌株 W5 对辣椒采后果疫病的防治效果  47-48
  5.3 小结与讨论  48-50
6 菌株 W5 在银杏叶片内的定殖研究  50-56
  6.1 材料与方法  50-52
    6.1.1 供试菌株  50
    6.1.2 供试苗木  50
    6.1.3 培养基  50
    6.1.4 质粒载体  50-51
    6.1.5 试剂与溶液  51
    6.1.6 绿色荧光蛋白和抗生素双重标记法测定菌株 W5 在银杏叶片内的定殖动态  51-52
      6.1.6.1 绿色荧光蛋白和抗生素双标记菌株的构建  51
      6.1.6.2 接种和取样方法  51
      6.1.6.3 内生细菌的分离与计数  51
      6.1.6.4 切片观察  51-52
  6.2 结果与分析  52-54
    6.2.1 荧光标记菌 W5-GFP 的构建  52
    6.2.2 抗生素标记法测定菌株 W5 在银杏叶片内的定殖动态  52-53
    6.2.3 绿色荧光标记法测定菌株 W5 在银杏叶片内的分布动态  53-54
  6.3 小结与讨论  54-56
总结  56-58
参考文献  58-61
致谢  61

银杏内生细菌W5的分离鉴定及其定殖的初步研究

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