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棉蚜对吡虫啉抗性机理的研究

作　者: 石绪根
导　师: 王开运
学　校: 山东农业大学
专　业: 农药学
关键词: 棉蚜吡虫啉抗性筛选抗性机理靶标突变
分类号: S435.622.1
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
下　载: 104次
引　用: 1次
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内容摘要

棉蚜Aphis gossypii (Glover)是一种世界性棉花害虫,由于其世代历期短,繁殖力强,加之田间不合理的用药习惯,导致我国田间棉蚜抗药性迅速发展且抗性背景相当复杂,这为该虫的化学防治造成了严重的困难。吡虫啉作为第一个商品化的新烟碱类杀虫剂,自上世纪90年代初开始推广使用,早已成为田间防治棉蚜的骨干药剂。为了延缓棉蚜对吡虫啉的抗性发展,延长其田间使用寿命,本研究通过室内抗性筛选、生物适合度以及交互抗性研究,系统分析了棉蚜对毗虫啉产生高水平抗性的风险；同时以室内筛选的抗性品系和敏感品系棉蚜为研究材料,利用现代分子生物技术,研究分析了棉蚜对吡虫啉产生抗性的生化和分子机制,旨在为该类药剂的科学使用提供指导。研究结果如下：1、抗吡虫啉棉蚜品系的室内筛选及抗性风险评估以杀死棉蚜群体60%-70%的剂量对敏感品系棉蚜持续筛选60代后,该品系棉蚜对吡虫啉的抗性达72.8倍,已经产生了高水平的吡虫啉抗性。该棉蚜品系从F0代筛选至F54代,抗性发展趋势较为平稳,抗性增加至47.0倍,达中等抗性水平；但由F54代筛选至F57代,抗性迅速由47.0倍增长至69.5倍,出现抗性突增期；由F57至F60抗性仍有小幅升高,但其发展又趋于缓慢,证明棉蚜对吡虫啉抗性发展趋势呈偏“S”型曲线。该抗性品系对烯啶虫胺(16.0倍)、啶虫脒(12.9倍)、噻虫嗪(11.6倍)、噻虫胺(9.84倍)、呋虫胺(9.50倍)、丁硫克百威(8.38倍)、高效氯氟氰菊酯(6.17倍)、氧乐果(6.13倍)和毒死蜱(5.10倍)均产生了明显的的交互抗性,但对哒螨灵和吡蚜酮的交互抗性水平较低(分别为2.28倍和4.52倍)。吡虫啉抗性和敏感品系生物学特性研究发现,RF60的蜜露分泌量、体重、若蚜存活率、内禀增长率和周限增长率均有所下降,特别是净生殖率,仅为敏感品系的47.7%,且世代周期延长了1.4天左右,相对适合度下降为0.71。尽管吡虫啉使用中前期棉蚜对其抗性发展比较缓慢,但连续大量使用仍会导致抗性突增,因此尚存在产生高水平抗性的风险。交互抗性问题能够显著影响吡虫啉和大部分常规药剂特别是新烟碱类药剂的防效,在抗性治理中,仅有少数杀虫剂能够作为替代药剂使用。吡虫啉在棉蚜种群上会产生抗性代价,令其生长、发育和繁殖方面均受到一定程度的影响,从而使抗性品系群体增长受到抑制。2、棉蚜对吡虫啉抗性的生化机理研究以室内选育的吡虫啉抗性品系(抗性达72.8倍)和敏感品系棉蚜为材料,分别测定了四种解毒酶抑制剂对毗虫啉的增效作用,并且比较了两个品系棉蚜的解毒酶活性。其中SV1、DEM在棉蚜抗吡虫啉品系和敏感品系中均没有表现出明显的增效作用；而TPP和PBO则对吡虫啉起到了明显的增效作用,且在抗性品系中的增效作用显著高于在敏感品系中的增效作用；其中PBO的增效作用最为明显,在抗性品系中的增效比达到了2.97。酶活性测定结果表明,抗吡虫啉棉蚜品系的羧酸酯酶和乙酰胆碱酯酶比活力均高于敏感品系,尤其以羧酸酯酶比活力的提高最明显,而谷胱甘肽-S-转移酶的变化却并不显著。这些结果表明：多功能氧化酶和羧酸酯酶在棉蚜对吡虫啉产生抗性的过程中起到了重要的作用,而乙酰胆碱酯酶也起到了一定的辅助作用。3、棉蚜对吡虫啉抗性的分子机理研究以吡虫啉抗性品系和敏感品系棉蚜为材料,分别克隆了一个羧酸酯酶基因,两个P450单加氧酶六家族基因,五个乙酰胆碱受体α亚基和一个β亚基的cDNA序列,所有基因序列经同源序列比对后证实分别为棉蚜各功能基因。抗性和敏感品系棉蚜的羧酸酯酶及P450单加氧酶基因序列比对后并未发现抗性相关突变,但进一步的荧光定量分析发现,CYP6CY3-1基因在抗性品系棉蚜体内过量表达了5.66倍,羧酸酯酶基因过量表达了1.24倍,仅CYP6CY3-2基因的表达量未出现明显变化(1.03倍)。本研究得到的Agα2与Aga4亚基基因序列与NCBI上已登录的棉蚜乙酰胆碱受体α2和β4亚基cDNA序列相比更加完整,包含了翻译氨基酸序列所需的完整开放阅读框。比对各亚基氨基酸序列后发现,在抗性品系棉蚜Agβ1亚基上存在单一的位点突变R81T。羧酸酯酶与P450单加氧酶基因的过量表达进一步证实了这两个解毒酶系在棉蚜对吡虫啉的抗性产生中起到了重要的作用。而本研究在抗吡虫啉棉蚜中首次发现的R81T氨基酸取代已被证实能够显著降低乙酰胆碱受体与吡虫啉的亲和力,因此,R81T突变直接导致了棉蚜对吡虫啉高水平抗性的产生。综上所述,本研究通过室内选育明确了棉蚜对吡虫啉的高水平抗性风险,并通过抗性机理分析确定了靶标位点突变是棉蚜对吡虫啉产生高水平抗性的主要原因,同时P450单加氧酶和酯酶活力的升高也是棉蚜对吡虫啉产生抗性的机理之一。显然,本研究结果对建立田间抗性分子监测手段,制定合理的抗性治理策略,延缓田间棉蚜抗药性的发展具有重要指导意义。

全文目录

中文摘要  11-13
Abstract  13-16
1 引言  16-45
  1.1 棉蚜抗药性研究现状  16-24
    1.1.1 棉蚜对各类常规杀虫剂的抗性研究  16-19
    1.1.2 棉蚜对吡虫啉等新烟碱类杀虫剂的抗性研究报道  19-20
    1.1.3 棉蚜对杀虫剂的交互抗性及抗性稳定性  20-21
    1.1.4 影响棉蚜抗药性形成与发展的因素  21-24
      1.1.4.1 寄主植物的影响  21-23
      1.1.4.2 繁殖力强  23
      1.1.4.3 扩散与迁飞  23-24
      1.1.4.4 用药阈值  24
  1.2 棉蚜对杀虫剂产生抗性的机制  24-31
    1.2.1 行为抗性  24
    1.2.2 表皮穿透速率降低  24-25
    1.2.3 代谢抗性  25-28
      1.2.3.1 酯酶  25-27
      1.2.3.2 多功能氧化酶  27-28
      1.2.3.3 谷胱甘肽-S-转移酶  28
    1.2.4 靶标抗性  28-31
      1.2.4.1 乙酰胆碱酯酶  29
      1.2.4.2 烟碱型乙酰胆碱受体  29-30
      1.2.4.3 击倒抗性  30-31
  1.3 吡虫啉研究概况  31-38
    1.3.1 吡虫啉等新烟碱类杀虫剂的发现与研究概况  31-32
    1.3.2 吡虫啉的安全性评价及其对天敌生物的安全性  32-33
    1.3.3 吡虫啉等新烟碱类杀虫剂的作用机理  33-36
      1.3.3.1 电生理与配体结合验证试验  33-34
      1.3.3.2 新烟碱类的分子特点及在选择性上的作用  34-35
      1.3.3.3 碱性氨基酸残基的作用  35
      1.3.3.4 C环上YXCC模序的作用  35-36
    1.3.4 昆虫对吡虫啉等新烟碱类杀虫剂的抗性发生概况  36-38
  1.4 烟碱型乙酰胆碱受体研究进展  38-44
    1.4.1 乙酰胆碱受体的结构与功能  38-43
      1.4.1.1 脊椎动物烟碱型乙酰胆碱受体的研究  40-41
      1.4.1.2 昆虫烟碱型乙酰胆碱受体的研究  41-43
    1.4.2 乙酰胆碱受体的配体及激动剂  43-44
  1.5 本研究的目的和意义  44-45
2 材料与方法  45-60
  2.1 供试试剂、药剂和主要仪器  45-47
    2.1.1 主要化学试剂  45-46
    2.1.2 主要分子试剂  46
    2.1.3 供试药剂  46-47
    2.1.4 主要仪器  47
  2.2 供试昆虫  47-48
  2.3 毒力测定方法  48
  2.4 抗吡虫啉棉蚜对其它药剂的交互抗性  48
  2.5 酶抑制剂对药剂的增效作用测定  48
  2.6 药剂对不同棉蚜品系适合度的影响  48-49
    2.6.1 不同品系棉蚜蜜露分泌的差异  48-49
    2.6.2 不同品系棉蚜体重的差异  49
    2.6.3 实验品系生命表的构建  49
  2.7 生化测定方法  49-54
    2.7.1 羧酸酯酶活性测定  49-51
      2.7.1.1 试剂配制  49-50
      2.7.1.2 标准曲线制备  50
      2.7.1.3 酶源制备  50
      2.7.1.4 羧酸酯酶比活力测定  50-51
    2.7.2 乙酰胆碱酯酶活性测定  51-52
      2.7.2.1 试剂配制  51
      2.7.2.2 标准曲线制备  51
      2.7.2.3 酶液制备  51
      2.7.2.4 乙酰胆碱酯酶比活力测定  51-52
      2.7.2.5 结果与计算  52
    2.7.3 谷胱甘肽-S-转移酶活性测定  52-53
      2.7.3.1 试剂的配制  52
      2.7.3.2 酶源的制备  52
      2.7.3.3 谷胱甘肽-S-转移酶比活力测定  52-53
    2.7.4 酶源蛋白含量测定  53-54
      2.7.4.1 试剂配制  53
      2.7.4.2 标准曲线的制备  53-54
      2.7.4.3 酶源制备  54
      2.7.4.4 酶源蛋白质含量的测定  54
  2.8 分子实验方法  54-59
    2.8.1 总RNA提取  54-55
    2.8.2 RNA纯度及浓度检测  55
    2.8.3 RT—PCR  55-56
    2.8.4 引物设计  56-57
    2.8.5 PCR  57
    2.8.6 PCR产物的纯化、克隆及测序  57-58
      2.8.6.1 PCR产物的纯化  57-58
      2.8.6.2 载体连接  58
      2.8.6.3 转化反应和扩大培养  58
      2.8.6.4 测序  58
    2.8.7 荧光定量PCR  58-59
  2.9 数据分析  59-60
3 结果与分析  60-86
  3.1 抗性发展趋势  60-61
  3.2 抗吡虫啉棉蚜对11种药剂的交互抗性  61-63
  3.3 不同棉蚜品系生物学特性测定结果  63-64
    3.3.1 不同棉蚜品系的蜜露分泌差异  63
    3.3.2 不同棉蚜品系的体重差异  63-64
  3.4 增效剂对毗虫啉的增效作用  64-65
  3.5 生化测定结果  65-68
    3.5.1 蛋白质含量标准曲线  65
    3.5.2 不同棉蚜品系羧酸酯酶的比活力  65-67
      3.5.2.1 羧酸酯酶标准曲线  65-66
      3.5.2.2 羧酸酯酶比活力  66
      3.5.2.3 不同棉蚜品系羧酸酯酶的Km值及Vmax  66-67
    3.5.3 不同棉蚜品系乙酰胆碱酯酶的比活力  67-68
      3.5.3.1 乙酰胆碱酯酶标准曲线  67
      3.5.3.2 乙酰胆碱酯酶比活力  67-68
    3.5.4 不同棉蚜品系谷胱甘肽-S-转移酶的比活力  68
  3.6 羧酸酯酶及P450单加氧酶基因研究结果  68-74
    3.6.1 不同品系羧酸酯酶cDNA蛋白编码区基因序列比较分析  68-69
    3.6.2 不同品系P450单加氧酶cDNA蛋白编码区基因序列比较分析  69-71
    3.6.3 P450 CYP6基因分子树的构建和系统发育分析  71-72
    3.6.4 羧酸酯酶与P450单加氧酶基因表达量结果与分析  72-74
      3.6.4.1 总RNA质量及浓度  72
      3.6.4.2 荧光定量PCR的特异性和重复性  72-73
      3.6.4.3 羧酸酯酶与P450单加氧酶基因表达量结果与分析  73-74
  3.7 棉蚜烟碱型乙酰胆碱受体各亚基基因比较分析  74-86
4 讨论  86-95
  4.1 棉蚜对吡虫啉的抗性发展  86-87
  4.2 抗吡虫啉棉蚜品系对部分常用药剂的交互抗性  87-88
  4.3 抗吡虫啉棉蚜品系的生物适合度  88-89
  4.4 棉蚜对吡虫啉产生抗性的生化机理分析  89-91
  4.5 棉蚜对吡虫啉产生抗性的分子机理分析  91-95
5 结论  95-97
参考文献  97-114
致谢  114-115
攻读学位期间发表论文情况  115

棉蚜对吡虫啉抗性机理的研究

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