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水稻细菌性条斑病菌遗传多样性研究与生防菌剂研发

作　者: 张荣胜
导　师: 陈志谊
学　校: 南京农业大学
专　业: 农药学
关键词: rep-PCR 水稻细菌性条斑病菌 致病型 解淀粉芽孢杆菌 响应曲面法 防卫反应基因
分类号: S435.111.4
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


水稻细菌性条斑病由Xanthomonas oryzae pv. oryzicola (Xooc)引起,是水稻生产中一种重要的检疫性病害,其发生具有流行性、暴发性和毁灭性等特点。该病是我国南方稻区生产的重要病害,当气候条件适宜时,在感病品种上能引起15%～25%产量损失,严重时达40%～60%,对水稻的高产稳产造成严重威胁。品种抗病性是寄主与病原物互作的结果,深入了解病原物群体遗传结构的变化,可作为抗性基因合理分布的依据。主要研究如下：本文通过rep-PCR指纹技术,分析了来源于江苏、云南、江西、湖南和安徽等省份69个水稻细菌性条斑病菌(X. oryzae pv. oryzicola)群体遗传多样性。用2对特异性引物BOX和ERIC对菌株基因组DNA进行了PCR扩增,以彼此间的带位相似率达80%为界,BOX扩增的谱型被分为10簇,ERIC的谱型被分为8簇。BOX的第3簇包含27个菌株,占总数的39.1%,ERIC的第5簇包含24个菌株,占总数的34.8%,均为优势簇。群体遗传多样性值BOX为0.9784,ERIC为0.9833。说明水稻细菌性条斑病菌群体的遗传分化明显,遗传多样性较高。全部69株菌株接种于含有不同抗病基因近等基因系及高感品种金刚30等6个鉴别品种上,被划分为13个致病型,其中C6致病型占26.1%,为优势致病型。69个菌株的BOX、ERIC的簇群分类与地理位置相关,与致病型不相关。其次对来源于江苏、云南、江西、湖南和安徽等省细菌性条斑病菌菌株,通过采用苗期注射接种和成株期针刺接种法,研究其在6个鉴别品种(金刚30、IRBB4、 IRBB5、IRBB14、IRBB21和IRBB24)上致病力分化及其对水稻幼苗和成株致病力差异,为品种布局和条斑病菌致病力快速鉴定提供理论依据。试验结果显示,71个条斑病菌菌株在苗期和成株期可分别区分为18个和13个致病型；苗期的优势致病型为C1,占供试菌株总数的17.0%；成株期的优势致病型为C10,占供试菌株总数的25.4%。研究还表明：大多数菌株与水稻品种之间表现为弱互作关系,只有一部分菌株表现为强互作关系。就单个菌株而言,在苗期和成株期的致病力分化是不一致的。整体而言,71个菌株在6个鉴别品种的苗期上可侵染241次,侵染率为56.6%；在成株期上有245次侵染,总侵染率为57.5%。病原菌在不同水稻品种的苗期和成株期上的侵染能力是基本相同的。同时采集江苏省南京、泰州、扬州和宿迁等地区水稻田水稻病叶、健叶、根围土等样品90份,分离纯化得到1173个细菌分离物,对其进行水稻细菌性条斑病菌(X. oryzae pv. oryzicola)皿内抑制试验,共获得12株拮抗能力较强的细菌,其中4株拮抗细菌抑菌圈直径大于27mm。盆栽试验结果表明,12株拮抗能力较强的细菌中有4株对水稻细菌性条斑病防效大于50%。其中菌株Lx-11盆栽防效达62.5%,大田示范试验防效达60.2%,显著高于化学药剂20%叶枯唑的防效(51.2%和45.8%)。通过形态特征、理化特性和分子鉴定结果确定菌株Lx-11为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens.对前期筛选获得和在田间试验中防治水稻细菌性条斑病效果较好的解淀粉芽孢杆菌Lx-11,通过Plackett-Burman单因素筛选及Box-Behnken响应曲面法(response surface methodology, RSM)对影响生防菌株Lx-11生物发酵工艺进行了优化。试验结果表明,培养温度、通气量和接种量是影响发酵活菌数和抑菌活性的主要因子,由所得响应曲面方程预测出这3个主要因子分别为30.84℃、59.68mL/250mL和1.52%时,发酵活菌数和抑菌活性的最大值为3.75×109cm·mL-1和8.2mm。经摇瓶发酵试验和抑菌活性验证该理论预测值与实际值无显著差异。Lx-11菌株分泌的脂肽类抗生素物质包括surfactin, bacillomycin D和fengycin三大类,通过构建surfactin突变体菌株发现surfactin在防治细菌性条斑病中起主要作用。生防菌处理水稻植株后能够诱导植株防卫反应相关基因PR-la、PR-1b、NPR1和PAL基因的表达,并在处理24小时后达到最大值,表明Lx-11菌株引发植株产生系统免疫反应。

全文目录


摘要  8-10
ABSTRACT  10-13
上篇 文献综述  13-54
  第一章 水稻细菌性条斑病概述及其研究进展  14-30
    1 水稻细菌性条斑病  14-18
      1.1 发生和分类  14
      1.2 病害症状  14-15
      1.3 水稻细菌性条斑病病原菌检测  15-16
      1.4 初侵染来源、传播途径及发病规律  16-17
      1.5 防治策略  17-18
    2 水稻细菌性条斑病菌遗传多样性和致病力分化概述  18-20
      2.1 分子标记技术在水稻细菌性条斑病菌群体遗传中应用  18-19
      2.2 水稻细菌性条斑病菌致病力分化研究  19-20
    3 水稻细菌性条斑病菌致病基因研究  20-22
      3.1 水稻黄单胞菌hrp基因簇特征  20-21
      3.2 胞外多糖  21
      3.3 DSF信号分子  21-22
    4 水稻细菌性条斑病抗性育种  22-24
      4.1 水稻品种细菌性条斑病抗性鉴定  22
      4.2 水稻细菌性条斑病抗性基因遗传分析  22-23
      4.3 外源抗水稻细菌性条斑病基因的研究  23-24
    参考文献  24-30
  第二章 植物病害生防芽孢杆菌研究进展  30-44
    1 芽孢杆菌生防作用机制  30-35
      1.1 营养和空间位点竞争  31
      1.2 分泌抗菌物质  31-34
      1.3 溶菌作用  34
      1.4 诱导植物抗病性  34-35
    2 芽孢杆菌应用现状  35-36
      2.1 国外生防芽孢杆菌的应用现状  35
      2.2 国内生防促生芽孢杆菌的研发概况  35-36
    3 存在问题和措施  36-37
      3.1 生防芽孢杆菌在实践应用中存在的问题  36-37
      3.2 问题的对策  37
    4 展望  37-38
    参考文献  38-44
  第三章 芽孢杆菌非核糖体脂肽类抗生素的合成及生防作用  44-54
    1 脂肽类化合物合成及其结构  44-48
      1.1 表面活性素  46
      1.2 伊枯草菌素  46-47
      1.3 泛革素  47-48
    2 聚酮类化合物  48-49
    3 非核糖体肽类化合物在生物防治中的作用  49-50
      3.1 非核糖体类中的脂肽类抗生素在生防菌定殖中的作用  49
      3.2 非核糖体类抗生素的拮抗作用  49-50
      3.3 脂肽类抗生素对植物的诱导抗性作用  50
    4 展望  50-51
    参考文献  51-54
下篇 研究内容  54-121
  第一章 水稻细菌性条斑病菌遗传多样性和致病力分化研究  55-67
    摘要  55
    ABSTRACT  55-56
    1 材料与方法  56-58
      1.1 供试菌株  56-57
      1.2 鉴别品种  57
      1.3 接种与调查  57
      1.4 菌株基因组DNA提取  57
      1.5 rep-PCR反应  57-58
      1.6 数据分析  58
    2 结果与分析  58-62
      2.1 水稻细菌性条斑病菌致病力分化  58-59
      2.2 水稻细菌性条斑病菌致病型与地理位置的关系  59-60
      2.3 BOX-PCR和ERIC-PCR结果分析  60-61
      2.4 BOX-PCR和ERIC-PCR结果比较  61-62
      2.5 水稻细菌性条斑病菌的簇群与地理位置、致病型的关系  62
    3 讨论  62-65
    参考文献  65-67
  第二章 水稻细菌性条斑病菌致病力分化及其对水稻幼苗和成株的致病力差异  67-77
    摘要  67
    ABSTRACT  67-68
    1 材料和方法  68-70
      1.1 水稻条斑病标样采集  68-69
      1.2 菌株分离  69
      1.3 供试水稻鉴别品种  69
      1.4 接种方法  69
      1.5 菌株致病型的划分  69
      1.6 菌株对水稻品种的侵染率  69-70
    2 结果与分析  70-72
      2.1 水稻条斑病菌在6个鉴别品种苗期、成株期的致病力分化情况  70-71
      2.2 水稻条斑病菌在不同生育期致病力分化拟合情况  71-72
    3 讨论  72-74
    参考文献  74-77
  第三章 水稻细菌性条斑病菌拮抗细菌的筛选、评价与应用研究  77-89
    摘要  77
    ABSTRACT  77-78
    1 材料与方法  78-80
      1.1 试验材料  78
      1.2 拮抗细菌的分离和纯化  78
      1.3 拮抗细菌室内抑菌能力的测定  78-79
      1.4 拮抗细菌对水稻的促生作用测定  79
      1.5 拮抗细菌对水稻细菌性条斑病盆栽防治效果测定  79
      1.6 拮抗细菌对水稻细菌性条斑病田间小区和大田示范试验防治效果的测定  79-80
      1.7 拮抗细菌Lx-11的鉴定  80
      1.8 数据处理  80
    2 结果与分析  80-84
      2.1 拮抗细菌的分离与筛选  80-82
      2.2 拮抗细菌对水稻细菌性条斑病的盆栽和田间防治效果  82-83
      2.3 菌株Lx-11的鉴定  83-84
    3 讨论  84-86
    参考文献  86-89
  第四章 解淀粉芽孢杆菌Lx-11生物发酵工艺优化  89-103
    摘要  89
    ABSTRACT  89-90
    1 材料方法  90-92
      1.1 供试菌株和培养基  90
      1.2 方法  90-91
      1.3 发酵液菌含量和抑菌活性的测定  91
      1.4 试验设计  91
      1.5 Box-Behnken响应曲面法(response surface methodology,RSM)试验设计  91-92
      1.6 数据分析  92
    2 结果与分析  92-99
      2.1 培养条件中的显著影响因子  92-93
      2.2 关键因子的最优范围  93
      2.3 关键因子的最优配比  93-98
      2.4 试验结果的发酵验证  98-99
    3. 讨论  99-100
    参考文献  100-103
  第五章 解淀粉芽孢杆菌Lx-11防治水稻细菌性条斑病的生防机理研究  103-121
    摘要  103
    ABSTRACT  103-104
    1 材料和方法  104-108
      1.1 试验材料  104-105
      1.2 surfactin突变体菌株构建  105-106
      1.3 脂肽类抗菌物质的提取  106
      1.4 基质协助激光解吸附离子化-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和高效液相-串联质谱(HPLC-ESI-MS)检测  106
      1.5 抑菌活性检测  106-107
      1.6 水稻细菌性条斑病盆栽防治效果测定  107
      1.7 水稻细菌性条斑病田间小区试验防治效果的测定  107
      1.8 RT-PCR和Real time RT-PCR检测防卫反应基因表达  107-108
      1.9 数据分析  108
    2 结果与分析  108-115
      2.1 平板抑菌试验  108
      2.2 脂肽类物质的MALDI-TOF-MS分析  108-110
      2.3 野生型菌株、突变体菌株和脂肽类物质对水稻条斑病的防效  110-113
      2.4 RT-PCR和Real time RT-PCR检测防卫反应基因表达  113-115
    3 讨论  115-117
    参考文献  117-121
全文总结  121-123
本论文创新点  123-125
附录  125-135
致谢  135-137
攻读博士期间发表的论文和专利  137

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 农作物病虫害及其防治 > 禾谷类作物病虫害 > 稻病虫害 > 病害 > 侵（传）染性病害
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