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菜青虫酚氧化酶原编码基因的分子克隆及其表达研究

作　者: 李滨
导　师: 薛超彬
学　校: 山东农业大学
专　业: 农药学
关键词: 菜青虫酚氧化酶昆虫免疫荧光定量PCR 人工接种
分类号: S433
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

酚氧化酶（phenoloxidase，EC.1.14.18.1，简称PO）是一种重要的酶类，广泛存在于无脊椎动物、脊椎动物、植物、细菌和真菌等生物体内，在昆虫变态发育和免疫系统中起着重要作用，主要功能可总结为：（1）参与表皮的硬化和黑化；（2）对卵壳的鞣化作用；（3）参与伤害防御；（4）加速伤口的愈合等，是一种潜在的靶标酶。本文通过RT-PCR和RACE技术，克隆得到了编码菜青虫（Pieris rapae）酚氧化酶原的两个基因Prophenoloxidase-1（PrPPO1）和Prophenoloxidase-2（PrPPO2），并对序列信息进行了分析；并通过Semi-Quantitative RT-PCR和QuantitativeReal-time PCR研究了PPO1和PPO2在菜青虫不同发育时期的表达情况；并用白僵菌制剂注射菜青虫5龄幼虫，研究白僵菌分生孢子对菜青虫PPO转录活性的影响，同时使用两种典型的PO抑制剂——槲皮素和曲酸，对菜青虫5龄幼虫进行了处理，测定了处理后4h、8h和12h时PPO1的表达情况。研究结果如下：1. PrPPO1全长cDNA序列有3338bp，包含一个2049bp的开放阅读框（ORF），一个63bp的5’非编码区（5’UTR）和一个1226bp的带有加尾信号的3’非编码区（3’UTR）。开放阅读框从第64个核苷酸开始，终止于第2102个核苷酸，由其推导的氨基酸序列以甲硫氨酸为起始氨基酸，长为682个氨基酸，分子量为78.57kDa，估测等电点pI为6.37。2. PrPPO2部分cDNA序列有1679bp，包含一个1173bp的开放阅读框（ORF）和一个506bp的带有加尾信号的3’非编码区（3’UTR）。开放阅读框从第1个核苷酸开始，终止于第1173个核苷酸，由于该片段为部分cDNA，其他相关参数不做预测。3. PrPPO1基因的氨基酸序列与其它鳞翅目昆虫PPOl基因具有较高的同源性（69.73%~73.15%）；PrPPO2基因的氨基酸序列与其它鳞翅目昆虫PPO2基因具有较高的同源性（70.0%~72.0%）。4. PrPPO1和PrPPO2各均具有两个高度保守的铜离子结合位点，及位于铜离子结合位点内的6个保守的组氨酸残基，此外，PrPPO1还包含一个类似于脊椎动物的α-巨球蛋白的硫羟酸酯区域。PrPPO1与PrPPO2的N端均不含信号肽，不存在跨膜结构域。5. PrPPO1中，α-螺旋占17.16%，随机卷曲63.20%，它们是PrPPO1最大量的结构元件，延伸链占19.65%，散布在整个蛋白质中，无β转角存在，同源建模显示PrPPO1三级结构均为“α/β型”中的“滚筒结构”。6. PrPPO1在成虫中的表达量设定为1.0，PrPPO1在卵和4龄幼虫中表达量最高，表达量分别为2.76和5.60；PrPPO1在5龄幼虫和蛹中表达量较低，为0.21和0.26；在1龄、2龄、3龄幼虫中，PrPPO1的表达量比较接近，分别为2.16、1.82和1.52。PrPPO2在成虫中的表达量设定为1.0，PrPPO2在4龄幼虫中表达量最高，表达量为13.24；卵和3龄幼虫次之；PrPPO2在5龄幼虫中表达量较低，为0.96；在1龄和2龄幼虫中，PrPPO1的表达量比较接近，分别为2.98和2.65；预蛹和蛹比较接近，分别为1.91和1.42。通过Real-time PCR和RT-PCR比较PrPPO表达量变化结果非常相近。7.白僵菌接种试验中，侵染组和对照组（PBS）在6h-12h之间PrPPO1的表达量均有大幅度的升高，在12h的表达量分别为6h的5.67倍和5.0倍。而在12h后直至24h，PrPPO1的表达水平开始回落，且在整个实验过程中侵染组和对照组（PBS）PrPPO1的表达水平差距不明显，说明白僵菌侵染菜青虫对PPO影响甚微。8.在不同浓度的槲皮素和曲酸注射菜青虫的条件下，PrPPO1的转录活性抑制不明显。

全文目录

摘要  9-12
Abstract  12-16
1 引言  16-42
  1.1 文献综述  16-38
    1.1.1 酚氧化酶的起源  17-19
    1.1.2 酚氧化酶的分布与定位  19-22
    1.1.3 酚氧化酶的免疫功能  22-27
    1.1.4 酚氧化酶的分子生物学研究  27-33
    1.1.5 酚氧化酶的主要功能  33-36
    1.1.6 酚氧化酶抑制剂的研究及应用前景  36-38
  1.2 选题目的和意义  38-41
  1.3 本研究的技术路线  41-42
2 材料与方法  42-70
  2.1 试虫饲养  42
  2.2 试剂及仪器设备  42-45
    2.2.1 试剂  42-44
    2.2.2 仪器设备  44-45
  2.3 菜青虫总 RNA 的提取、鉴定及 cDNA 合成  45-49
    2.3.1 菜青虫总 RNA 的提取  45-47
    2.3.2 菜青虫总 RNA 的检测  47-48
    2.3.3 菜青虫第一链 cDNA 合成  48-49
  2.4 菜青虫酚氧化酶原基因 1（PrPPO1）的克隆  49-61
    2.4.1 PrPPO1 保守片段的扩增  49-55
    2.4.2 PrPPO1 全长序列的扩增  55-61
  2.5 菜青虫酚氧化酶原基因 2（PrPPO2）的克隆  61-63
    2.5.1 PrPPO2 保守片段的扩增  61-62
    2.5.2 PrPPO2 全长序列的扩增  62-63
  2.6 基因序列的生物信息学分析  63-64
    2.6.1 数据库搜索及菜青虫 PPO 基因编码蛋白的理化性质分析  63-64
    2.6.2 菜青虫 PPO 基因编码蛋白的结构和功能分析  64
  2.7 菜青虫不同发育时期两种酚氧化酶的表达研究  64-68
    2.7.1 PrPPO1 的表达研究  64-67
    2.7.2 PrPPO2 的表达研究  67-68
  2.8 白僵菌/槲皮素/曲酸处理后菜青虫 PrPPO1 的表达研究  68-70
    2.8.1 供试昆虫处理方法  68-69
    2.8.2 引物设计  69
    2.8.3 测定方法  69-70
3 结果与分析  70-96
  3.1 菜青虫总 RNA 的提取  70
  3.2 菜青虫酚氧化酶原基因 1（PrPPO1）的克隆  70-72
    3.2.1 菜青虫 PrPPO1 保守片段的扩增  70-71
    3.2.2 菜青虫 PrPPO1 全长序列的扩增  71-72
  3.3 菜青虫酚氧化酶原基因 2（PrPPO2）的克隆  72-73
    3.3.1 菜青虫 PrPPO2 保守片段的扩增  72
    3.3.2 菜青虫 PrPPO2 部分序列的扩增  72-73
  3.4 菜青虫 PPO 基因序列的生物信息学分析  73-92
    3.4.1 菜青虫 PPO 基因核苷酸序列、氨基酸序列组成和理化性质  73-83
    3.4.2 菜青虫 PPO 基因氨基酸序列同源性比较及系统进化树的构建  83-87
    3.4.3 菜青虫 PPO 基因信号肽、跨膜结构域分析  87-89
    3.4.4 菜青虫 PPO1 基因编码蛋白的二级结构分析  89-90
    3.4.5 菜青虫 PPO1 基因三级结构模型构建  90-92
  3.5 菜青虫不同发育时期两种酚氧化酶的表达研究  92-94
    3.5.1 PrPPO1 的表达研究  92
    3.5.2 PrPPO2 的表达研究  92-94
  3.6 白僵菌/槲皮素/曲酸处理后菜青虫 PrPPO1 表达研究  94-96
4 讨论  96-104
  4.1 菜青虫 PPO 基因的克隆和基因序列的生物信息学分析  96-98
  4.2 菜青虫不同发育时期两种酚氧化酶的表达研究  98-100
  4.3 白僵菌制剂处理后菜青虫 PrPPO1 的表达情况  100-101
  4.4 槲皮素/曲酸处理后菜青虫 PrPPO1 的表达研究  101-103
  4.5 对本课题后续研究的一些设想  103-104
5 结论  104-107
参考文献  107-127
附录  127-128
致谢  128-130
攻读学位期间发表论文情况  130

菜青虫酚氧化酶原编码基因的分子克隆及其表达研究

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