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干旱草原豆科植物根瘤菌物种多样性研究及应用试验

作　者: 肖猛
导　师: 刘晓云; 李志强
学　校: 河北大学
专　业: 微生物学
关键词: 干旱草原根瘤菌多样性田间应用分子标记
分类号: S182
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

本研究采用生理生化、16S rDNA PCR-RFLP、全细胞蛋白SDS-PAGE、16S rDNA全序列分析等分类技术,对91株分离自山西省右玉县和河北省张家口坝上地区豆科植物的根瘤菌进行了多相分类和系统发育研究,并对筛选的两株优良根瘤菌菌株进行了田间应用试验。生理生化性状测定结果表明,全部供试菌株均能耐受60℃(10min处理)的高温和10℃低温,28株供试菌株能在4℃生长,23株供试菌株能在含5%的NaCl的YMA平板上生长,16株供试菌株能在pH4.0的YMA平板上存活,除来源于山西右玉,宿主为胡枝子(Lespedeza bicolor)的菌株3527241和来源于河北张家口,宿主为扁蓄豆(Melissitns sp.)的菌株3136962、3136991与宿主为野豌豆(Vicia sepium)的菌株3137033、3137011五株供试菌株外,其它供试菌株均能在pH12.0 YMA平板上生长。生理生化聚类结果在83%相似水平上形成6个表观群,均为快生根瘤菌群。其中群1和群6分别与隶属根瘤菌属(Rhizobium)和中华根瘤菌属(Sinorhizobium)的已知种聚群。16S rDNA PCR-RFLP研究结果表明,91株供试菌株与7株参比菌株共产生17种遗传图谱类型。聚类分析树状图显示,在86%的相似水平可分为6个遗传群,其中只有2个群与隶属根瘤菌属(Rhizobium)和中华根瘤菌属(Sinorhizobium)的已知种聚群,其它菌群均未与已知参比菌株聚群。全细胞蛋白SDS-PAGE研究结果表明,在89%的相似水平可分为7个群。除群5聚群结果与16S rDNA PCR-RFLP聚群不同外,其余聚群结果相同。根据16S rDNA PCR-RFLP酶切图谱结果,对代表菌株进行了16S rDNA序列测定并对其系统发育地位进行分析,结果表明：9株代表菌株分布在4个系统发育分支中；其中来源于山西右玉,宿主分别为草木樨(Melilotus suaveolens)、拧条(Caragana korshinskii)的3526682和3526693与来源于河北张家口,宿主分别为黄芪(Astragalus sp.)、季豆(Phaseolus vulgaris)的3136771和3136921四株供试菌株位于中华根瘤菌属(Sinorhizobium);来源于河北张家口,宿主分别为野豌豆(Vicia sepium)、扁蓄豆(Melissitns sp.)的菌株3137033和3136961位于根瘤菌属(Rhizobium);来源于河北张家口,宿主为草木樨(Melilotus suaveolens)的菌株3137021与来源于山西右玉,宿主为黄芪(Astragalus sp.)的菌株3526632位于苍白杆菌属(Ochrobactrum);来源于山西右玉,宿主为胡枝子(Lespedeza bicolor)的菌株3526732位于叶瘤杆菌属(Phyllobacterium)根据生理生化和结瘤试验结果,选择抗逆性强(耐盐碱、耐低温)和结瘤数高的两株紫花苜蓿根瘤菌(SX01、HB02)进行了山西田间接种试验,采用BOX-PCR分子标记方法来检验两株紫花苜蓿根瘤菌的田间接种效果并计算其占瘤率。山西田间接种试验表明,施加根瘤菌SX01、HB02明显提高了中苜一号的株高、分枝数、叶面积、单株干重、单株有效瘤数等生长性状(P<0.05)；其株高、分枝数、叶面积、单株干重、单株有效瘤数比未施加根瘤菌分别提高11.7%、12.5%、30.0%、34.9%、21.5%和10.1%、10.2%、28.3%、34.2%、19.6%。为了检验根瘤菌菌株的接种效果和计算其占瘤率,采用BOX-PCR分子标记方法研究接种根瘤菌菌株的田间竞争结瘤能力。通过对接种供试菌株及田间分离获得的根瘤菌菌株进行BOX-PCR及不同菌株之间的BOX分子指纹图谱比较,检测供试菌株的田间占瘤率。实验结果表明,紫花苜蓿接种供试菌株60天后,SX01、HB02两株根瘤菌菌株的田间占瘤率分别达到46.7%、53.3%,说明这两株紫花苜蓿根瘤菌菌株均具有较强竞争结瘤能力,可以作为高效根瘤菌菌株进行田间推广和应用；同时也说明了BOX-PCR作为一种分子标记方法可对根瘤菌菌株竞争结瘤能力进行研究。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-11
第1章文献综述  11-21
  1.1 引言  11-12
  1.2 根瘤菌的多样性研究进展  12-16
    1.2.1 根瘤菌早期的分类系统  12-13
    1.2.2 根瘤菌最新的分类系统  13-16
  1.3 根瘤菌多样性的研究方法  16-17
    1.3.1 表型多样性研究方法  16
    1.3.2 遗传多样性研究方法  16-17
  1.4 根瘤菌的系统发育研究  17
  1.5 国内外根瘤菌应用概况  17-18
  1.6 紫花苜蓿根瘤菌的应用研究  18-19
  1.7 分子标记技术研究进展及在根瘤菌中的应用  19-20
  1.8 研究目的及意义  20
  1.9 研究内容  20-21
第2章干旱草原豆科植物根瘤菌物种多样性研究  21-41
  2.1 材料与方法  21-29
    2.1.1 样品采集、分离、纯化及保存  21
    2.1.2 供试菌株  21
    2.1.3 生理生化性状  21-26
    2.1.4 16S rDNA PCR-RFLP  26-27
    2.1.5 全细胞蛋白SDS—PAGE分析  27-29
    2.1.6 16S rDNA全序列测定及系统发育学分析  29
  2.2 结果与分析  29-41
    2.2.1 生理生化性状分析  29-31
    2.2.2 16S rDNA PCR-RFLP结果与分析  31-36
    2.2.3 全细胞蛋白SDS-PAGE结果与分析  36-38
    2.2.4 16S rDNA基因全序列测定及系统发育学分析  38-41
第3章干旱草原紫花苜蓿根瘤菌的田间应用  41-43
  3.1 材料与方法  41-42
    3.1.1 试验地概况  41
    3.1.2 研究内容与方法  41-42
    3.1.3 数据处理  42
  3.2 结果与分析  42-43
第4章分子标记对根瘤菌田间竞争结瘤能力研究  43-46
  4.1 材料与方法  43-44
    4.1.1 山西右玉试验地根瘤的采集及根瘤菌的分离、纯化  43
    4.1.2 DNA的提取  43
    4.1.3 BOX-PCR  43-44
  4.2 结果与分析  44-46
第5章讨论与结论  46-49
  5.1 讨论  46-48
    5.1.1 科植物根瘤菌生物多样性与系统发育分析  46-47
    5.1.2 紫花苜蓿根瘤菌的田间试验  47
    5.1.3 分子标记对根瘤菌田间竞争结瘤能力研究  47-48
  5.2 结论  48-49
参考文献  49-60
致谢  60-61
攻读学位期间取得的科研成果  61

干旱草原豆科植物根瘤菌物种多样性研究及应用试验

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