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酶抑制法检测有机磷农药

作　者: 王玉辉
导　师: 缪吉根；缪煜清
学　校: 浙江师范大学
专　业: 分析化学
关键词: 酶抑制法乙酰胆碱酯酶硫柳汞聚乙烯醇表面活性剂有机磷农药
分类号: X839.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

有机磷类杀虫剂具有广谱、高效、易降解、半衰期短等优点,已经被广泛应用在现代工农业中,给人类带了巨大的经济效益,而与此同时产生的环境和食品污染等问题也日益严重。绝大多数有机磷农药具有高毒性且在生物体内易积累,对人类、动物的健康及生存产生极大的威胁。要预防和处理有机磷农药引起的环境、食品污染,避免急性食物中毒事件的发生,就需要及时准确地检测有机磷,加强对有机磷农药分析方法的研究。近年来,有许多关于有机磷农药残留检测方法的文献报道。酶抑制法与光谱法、色谱法等传统方法相比,具有前处理简单,检测时间短,所需仪器、设备简单等特点,适于大量样品筛选及现场检测。酶抑制法检测的灵敏度和可靠性与所使用的酶有密切关系,目前,国内外的酶抑制法检测农药残留主要采用乙酰胆碱酯酶CAChE)。该酶主要从敏感昆虫头部以及电鳐、电鳗的电器官中提取,材料来源困难,提取过程复杂,.产量低,成本高,稳定性差、容易失活。要满足当前农药残留检测的需求,AChE的活性保存及稳定性研究就显得非常重要。鉴于此,本论文着重利用酶抑制原理、采用分光光度法研究了AChE的固定化及其在有机磷农药检测中的应用。具体研究内容及结果如下：1.硫柳汞在AChE活性保存中的作用以来源于电鳗的AChE为模型酶,以壳聚糖为模型载体,以硫柳汞为防腐剂,通过戊二醛交联,将AChE固定在壳聚糖上,制备了壳聚糖固定化AChE。考察了固定化条件对固定化酶活力的影响,研究了固定化酶的性质。含0.05%硫柳汞的固定化酶与普通固定化酶最适温度基本相同,均为38℃；含硫柳汞的固定化酶最适pH为7.8,普通固定化酶pH为7.6,含硫柳汞的固定化酶在50℃仍有较高热稳定性,而普通固定化酶活力明显下降；含0.05%硫柳汞的固定化酶在下25℃条件下放置30天以后仍保留92.3%的活力。2.发明了一种以水溶性聚乙烯醇为载体能用于均相反应的新型酶固定化技术制备水溶性聚乙烯醇(PVA)固定化AChE,考察了固定化条件对固定化酶活力的影响,对固定化酶和溶液酶进行了动力学研究,测定了米氏常数和最大反应速度。聚乙烯醇的浓度为0.6%时,固定酶的酶活损失最少,残留活力达到最高值97%；西维因对其抑制率达到了75%与自由酶的78%很接近；固定酶的Km值为0.16 mM、最大反应速率(Vmax)为0.058 A/min,非常接近于自由酶的Km值0.14 mM和Vmax值0.057 A/min。所有这些都说明了,从PVA-AChE酶膜中释放出来的AChE表现出来的催化活性几乎相当于自由酶。3.表面活性剂在水溶性固定化酶检测西维因农药残留中的新应用研究了三种不同类型的表面活性剂对固定化酶活性的影响,选择合适的表面活性剂作为检测体系的增敏剂、有机磷农药的增溶剂,反应体系的终止剂,提高水溶性固定化酶对西维因农药检测的灵敏度。反应20 mmin以后,加入等体积浓度为10%的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)做终止剂,1h内活力基本上没有变化,说明反应完全终止；反应体系中阳离子表面活性剂CTAB的浓度为0.1%时,使显色反应灵敏度的增加幅度达27%左右,对有马拉硫磷的检检测限低至4ng/mL。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-9
目录  9-12
引言  12-13
1 绪论  13-29
  1.1 有机磷农药  13-15
    1.1.1 有机磷农药的特点  13-14
    1.1.2 有机磷农药的毒性  14-15
  1.2 有机磷农药检测方法  15-20
    1.2.1 光谱法  15-16
    1.2.2 色谱法  16-20
      1.2.2.1 薄层色谱法  16-17
      1.2.2.2 气相色谱法  17-18
      1.2.2.3 高效液相色谱法  18-19
      1.2.2.4 色谱法与其它技术的联用  19-20
  1.3 酶抑制法检测有机磷农药  20-27
    1.3.1 乙酰胆碱酯酶(AChE)  20-21
    1.3.2 农药对AChE的抑制原理  21-23
    1.3.3 酶抑制法检测有机磷农药的研究进展  23-27
      1.3.3.1 固定化酶片法  23-24
      1.3.3.2 酶抑制分光光度法  24-25
      1.3.3.3 酶抑制生物传感器法  25-27
  1.4 本论文研究目标和内容  27-29
    1.4.1 研究目标  27
    1.4.2 研究内容  27-29
2 硫柳汞在AChE活性保存中的作用  29-39
  2.1 前言  29-30
  2.2 实验部分  30-32
    2.2.1 仪器和试剂  30
    2.2.2 实验原理  30-31
    2.2.3 实验方法  31-32
      2.2.3.1 溶液的配制  31
      2.2.3.2 壳聚糖膜的制备  31
      2.2.3.3 AChE活力的测定  31-32
  2.3 结果与讨论  32-38
    2.3.1 含硫柳汞的固定化酶的制备  32-34
      2.3.1.1 固化反应中pH值对酶活力的影响  32-33
      2.3.1.2 固化反应中硫柳汞浓度对酶活力的影响  33-34
      2.3.1.3 固化反应中给酶量对酶活力的影响  34
    2.3.2 含硫柳汞的固定化酶的性质  34-38
      2.3.2.1 最佳反应pH值  34-35
      2.3.2.2 最佳反应温度  35-36
      2.3.2.3 孵育温度固定化酶活力的影响  36-37
      2.3.2.4 固定化酶的适易保存条件  37-38
  2.4 本章小结  38-39
3 研制新型水溶性固定化酶膜用于西维因农药的检测  39-52
  3.1 前言  39-40
  3.2 实验部分  40-43
    3.2.1 实验原理  40-41
    3.2.2 仪器和试剂  41
    3.2.3 实验方法  41-43
      3.2.3.1 水溶性PVA溶液的配置  41
      3.2.3.2 PVA-AChE酶膜的制备  41-42
      3.2.3.3 实验步骤  42-43
  3.3 结果和讨论  43-51
    3.3.1 PVA浓度的优化  43-45
    3.3.2 米氏常数的测定  45-46
    3.3.3 酶用量的优化  46-47
    3.3.4 酶促反应时间和农药抑制时间的优化  47-49
    3.3.5 丙酮对固定化酶活性的影响  49-50
    3.3.6 西维因农药对酶的抑制曲线  50-51
    3.3.7 PVA-AChE酶膜稳定性的研究  51
  3.4 本章小结  51-52
4 表面活性剂在酶抑制法检检测有机磷农药中的新应用  52-62
  4.1 前言  52-53
  4.2 实验部分  53-54
    4.2.1 仪器和试剂  53
    4.2.2 实验方法  53-54
      4.2.2.1 实验原理  53
      4.2.2.2 溶液的配制  53-54
      4.2.2.3 固定化酶膜的制备  54
      4.2.2.4 AChE的测定  54
  4.3 结果与讨论  54-61
    4.3.1 表面活性剂对固定化酶活性的影响  54-56
    4.3.2 终止剂CTAB浓度的选择  56
    4.3.3 农药增溶剂Triton X-100浓度的选择  56-57
    4.3.4 温度的影响  57-58
    4.3.5 pH值的影响  58-59
    4.3.6 工作曲线  59-60
    4.3.7 回收率实验  60-61
  4.4 本章小结  61-62
参考文献  62-72
攻读学位期间取得的研究成果  72-73
致谢  73-74

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