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衣藻叶绿体PsbA启动子的克隆及活性检测

作　者: 张伟
导　师: 苏忠亮
学　校: 青岛科技大学
专　业: 生物工程
关键词: 衣藻叶绿体 PsbA启动子基因工程绿色荧光蛋白基因
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

衣藻作为一种模式绿藻已应用于多种研究中。由于它具有多种优点:基因组序列已测序完成,遗传机制比较清楚;既能自养,又能异养;体内含有一个大的杯状叶绿体,容易被转化;生长周期短,光合效率高,因此素有“绿色酵母”之称,常用作宿主细胞来表达外源蛋白。衣藻是唯一一种在细胞核、叶绿体和线粒体中实现外源基因转化的生物。但外源基因在叶绿体中表达量低下一直是困扰衣藻叶绿体生物反应器商业化的瓶颈。影响外源基因表达量的最主要因素之一是启动子的强弱。强启动子能提高外源基因的转化频率,从而提高外源基因的表达量。衣藻叶绿体光系统II反应中心蛋白D1基因(PsbA)的启动子通常被认为是一种强启动子。本研究中,克隆了莱茵衣藻叶绿体PsbA启动子,以期PsbA启动子能提高外源基因在衣藻叶绿体中的转录效率。本研究的主要内容如下:首先,提取了莱茵衣藻DNA总基因组,设计PsbA启动子引物,并以总基因组为模板克隆了PsbA启动子。其次,构建了质粒p64D-PsbA-aadA。将PsbA启动子连接到质粒p64D中壮观霉素抗性基因(aadA)的上游。转化大肠杆菌DH5α,经氨苄青霉素和壮观霉素的筛选,获得了阳性单克隆斑。初步证明了PsbA启动子在大肠杆菌中能调控外源基因的表达。最后,构建了质粒psk-PsbA-gfp。将绿色荧光蛋白基因(gfp)连接到PsbA启动子的下游。转化大肠杆菌,经筛选后,获得了阳性单克隆斑。利用荧光显微镜,观察到了具有绿色荧光的大肠杆菌。证明了PsbA启动子具有启动活性。本研究成果为衣藻叶绿体基因工程的进一步研究奠定了基础。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-10
第一章前言  10-22
  1 衣藻简介  10-12
    1.1 衣藻在生物分类系统中的地位  10
    1.2 衣藻的生活环境  10
    1.3 衣藻的细胞结构  10-11
    1.4 衣藻的生殖方式  11-12
      1.4.1 衣藻无性生殖  11
      1.4.2 衣藻有性生殖  11-12
    1.5 衣藻叶绿体  12
  2 衣藻基因工程的研究  12-16
    2.1 启动子的研究  12-13
    2.2 衣藻遗传转化技术  13-16
      2.2.1 核转化技术  13-15
      2.2.2 叶绿体转化技术  15
      2.2.3 线粒体转化技术  15-16
    2.3 目前在衣藻中表达的蛋白  16
  3 衣藻其他方面的研究  16-19
    3.1 衣藻对光合作用机理的研究  16-17
    3.2 衣藻产氢的研究  17-18
    3.3 衣藻产油的研究  18
    3.4 衣藻净化污水方面的研究  18
    3.5 衣藻固定二氧化碳的研究  18-19
  4 绿色荧光蛋白简介及其应用  19
  5 衣藻的研究前景  19-20
  6 本课题研究的目的及意义  20-22
第二章衣藻叶绿体 PSBA 启动子的克隆  22-33
  1 主要仪器与设备  22
  2 材料与试剂  22-25
    2.1 材料  22
    2.2 培养基  22-24
    2.3 主要酶及试剂  24-25
    2.4 载体和宿主菌  25
  3 实验方法  25-29
    3.1 莱茵衣藻的培养  25-26
    3.2 莱茵衣藻总DNA 的提取  26
    3.3 PsbA 启动子的PCR 引物  26-27
    3.4 PsbA 启动子的PCR 扩增  27
    3.5 PsbA 启动子片段的测序  27-29
      3.5.1 PsbA 启动子片段的胶回收  27-28
      3.5.2 PsbA 启动子片段与pMD 18-T vector 的连接  28
      3.5.3 感受态细胞DH5α的制备方法  28
      3.5.4 PsbA 启动子片段转化大肠杆菌  28-29
      3.5.5 大肠杆菌质粒DNA 的提取  29
      3.5.6 PsbA 片段的测序  29
  4 结果与分析  29-31
    4.1 PsbA 启动子的PCR 扩增结果  29-30
    4.2 PsbA 启动子片段的测序结果  30-31
  5 讨论  31-33
第三章质粒 P64D-PSBA-AADA 的构建及活性检测  33-41
  1 实验目的  33
  2 主要仪器与设备  33
  3 材料与试剂  33-34
    3.1 培养基  33
    3.2 主要酶及试剂  33
    3.3 载体和宿主菌  33-34
  4 实验方法  34-36
    4.1 质粒p64D-PsbA-aadA 的构建  34-36
      4.1.1 PsbA 启动子小片段的回收  34-35
      4.1.2 质粒p64D 大片段的回收  35
      4.1.3 PsbA 小片段与质粒p64D 大片段的连接  35-36
    4.2 PsbA 启动子的活性检测  36
  5 结果与分析  36-39
    5.1 质粒p64D-PsbA-aadA 的构建  36-37
    5.2 PsbA 启动子在质粒p64D-PsbA-aadA 中的活性检测  37-39
  6 讨论  39-41
第四章 PSBA 启动子在大肠杆菌中调控绿色荧光蛋白 GFP 基因的表达  41-55
  1 实验目的  41
  2 主要仪器与设备  41
  3 材料与试剂  41-43
    3.1 材料  41
    3.2 培养基  41-42
    3.3 主要酶及试剂  42
    3.4 载体和宿主菌  42-43
  4 实验方法  43-47
    4.1 质粒psk-PsbA-aadA 的构建  43-44
      4.1.1 PsbA-aadA-3’rbcL 小片段的回收  43
      4.1.2 质粒psk 大片段的回收  43-44
      4.1.3 PsbA-aadA-3’rbcL 小片段与质粒psk 大片段的连接  44
    4.2 质粒psk-PsbA-gfp 的构建  44-47
      4.2.1 gfp 基因的PCR 引物  44-45
      4.2.2 gfp 基因的PCR 扩增  45
      4.2.3 质粒psk-PsbA-gfp 的构建  45-47
    4.3 PsbA 启动子在大肠杆菌中调控gfp 基因的表达  47
  5 结果与分析  47-54
    5.1 质粒p64D-PsbA-aadA 与质粒psk 的酶切鉴定  47-48
    5.2 gfp 基因的PCR 扩增结果  48
    5.3 gfp 基因的测序结果  48-49
    5.4 质粒psk-PsbA-gfp 的构建结果  49-50
    5.5 PsbA 启动子在大肠杆菌中调控gfp 基因的表达结果  50-54
  6 讨论  54-55
第五章结论与展望  55-56
  1 结论  55
  2 展望  55-56
参考文献  56-60
致谢  60-61
攻读硕士期间发表的学术论文目录  61-62

衣藻叶绿体PsbA启动子的克隆及活性检测

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