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养殖场空气中细菌分布及耐药性研究

作　者: 李楠
导　师: 高宏伟
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 基础兽医学
关键词: 养猪场空气微生物细菌耐药性
分类号: S852.6
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

空气是人和动物赖以生存的重要环境因素,一些病原菌以空气为媒介(微生物气溶胶)进行扩散传播,不仅污染了养殖环境,甚至还可引起某些传染病的暴发流行,给养殖业造成巨大的经济损失。空气微生物的种类和含量已成为畜禽舍环境质量的重要指标,直接关系到饲养人员、养殖动物的健康以及生产性能的发挥。以往有关动物舍空气微生物的监测主要针对某种特定的致病菌或是某一类细菌,往往不能了解到空气中菌群分布的整体状况。此外,在对菌群的定性研究中,采用的方法大多依赖于传统的形态学、血清学、生化反应、分子生物学等方法,虽然这些技术在细菌鉴定方面各具特色,但均无法满足对空气微生物进行准确、快速、高通量的检测要求。近年来随着抗生素的大量使用,细菌耐药性、药物残留等问题日趋严重,抗生素和耐药株已对养殖环境造成了不同程度的污染,但有关空气中细菌耐药情况的调查相对较少,目前我国尚缺少此方面的研究资料。针对以上问题,本课题选取了长春市五家规模化养猪场,开展了如下研究,旨在对预防养殖场畜禽疾病、合理使用抗生素、改善饲养环境等方面提供理论依据。1.基于MALDI-TOF质谱技术的细菌检测方法的建立。利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪(Matrix-Assistant Laser Desorption /Ionization Time of Flight Mass Spectrometry, MALDI-TOF MS)建立了一套基于该技术的细菌检测方法(包括样品前处理方法、检测范围、激光能量等),并研究了培养基、培养时间、样品保存时间等实验条件的改变对细菌质谱图的影响。同时以16SrDNA测序法作为参照方法,利用MALDI-TOF质谱技术检测了50株分离株,评估其检测能力。结果显示,质谱检测方法重复性好,不受培养基、培养时间、不同型号仪器等实验条件的影响,所获图谱质量较好、特征峰数目多、信号强度高、离子峰的分布模式稳定。与16SrDNA测序法相比较,结果显示二者具有极高的一致性。以上结果表明,MALDI-TOF质谱技术具有可靠、快速、高通量检测细菌的能力。2.养殖场空气中细菌种类及耐药性整体分布情况。本研究采集了长春地区五家养猪场的空气样本,培养基法对样本进行分离培养,并利用上述建立的质谱技术检测法对空气分离株进行鉴定。结果显示,养殖场空气中细菌种类多为环境正常菌群及条件性病原菌。其中革兰氏阳性菌明显居多,占细菌总数的78.1%,以凝固酶阴性葡萄球菌为优势菌群,占据62.7%,其次为芽孢杆菌、气球菌属和罗氏菌属。革兰氏阴性菌中以肠杆菌属数量最多,不动杆菌属、假单胞菌属分别位居二、三位。利用Vitek32全自动微生物分析仪、药敏纸片等表型法对养殖场空气分离株进行了药物敏感性检测。结果显示,耐药株检出率较高,主要集中在对红霉素、克林霉素、四环素这些常用于饲料中促生长剂的药物,部分菌株表现出对青霉素类、喹诺酮类等临床上人兽共用药物的耐受性。研究表明,作为优势菌群的凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)耐药情况非常严重,尤其是耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(MRCNS)检出率高达65.9%,并伴随着多重耐药现象出现。此外,发现一株鼠鼻罗氏菌(Rothia nasimurium)对除万古霉素外的所有抗生素均表现出高水平耐药,这在以往有关罗氏菌的文献中未见报道。3.凝固酶阴性葡萄球菌耐药基因检测。为了深入了解当前长春地区养殖环境中耐药性的流行特点,本研究以CNS为研究对象,针对β内酰胺类、大环内酯类和四环素这三类耐药率较高的抗生素,采用PCR法对其相关耐药基因进行检测。结果显示mecA检出率为58.0%,部分菌株表现为苯唑西林耐药,mecA阴性结果;ermC(69.6%)是阳性率最高的大环内酯类耐药基因,其次是msrA(15.7%)和ermB(14.8%),未检测到ermA基因;四环素类耐药基因tetK(62.7%)检出率明显高于tetM(25.4%)。4.高水平多重耐药株鼠鼻罗氏菌的比较蛋白质组学研究。为了解鼠鼻罗氏菌产生耐药性的机制,本研究利用双向电泳和质谱技术比较了鼠鼻罗氏菌耐药株和敏感株全蛋白的变化差异,共筛选并鉴定出18个蛋白,并通过半定量RT-PCR的方法在mRNA水平上对18个差异蛋白进行了验证,结果有4种蛋白的基因在转录水平上表现出与双向电泳结果的一致性,经数据库查询及文献分析这4种蛋白很可能与鼠鼻罗氏菌的耐药性密切相关。通过以上研究结果,得出以下结论:1.本研究建立的基于质谱技术的检测方法能够快速、准确和高通量的检测鉴定细菌。2.明确了调查区域养殖场空气中以凝固酶阴性葡萄球菌为优势菌群的细菌分布特点,了解到被调查养殖场空气分离株对β内酰胺类、大环内酯类、四环素类等饲料和临床中常用抗生素具有不同程度的耐药性。3.明确了调查区域养殖场空气中优势菌群(CNS)耐药基因的分布特点:mecA,ermC,tetK分别与环境中CNS对β内酰胺类、大环内酯类及四环素耐药性的产生密切相关。4.利用蛋白质组学及半定量RT-PCR筛选并鉴定到的4种差异蛋白,很可能与鼠鼻罗氏菌的多重耐药性密切相关,这将有助于发现和探究这些蛋白的新功能,并为明确该菌的耐药机制奠定理论基础。

全文目录

中文摘要  7-9
Abstract  9-12
前言  12-13
第一篇研究内容  13-81
  第一章基于MALDI-TOF质谱技术的细菌检测方法的建立  13-31
    1 材料与方法  13-18
      1.1 材料  13-14
      1.2 方法  14-18
    2 结果  18-29
      2.1 样品处理方法  18-20
      2.2 质谱图的重复性  20-26
      2.3 MALDI-TOF MS检测方法的评估结果  26-29
    3 讨论  29-30
      3.1 细菌样品制备  29
      3.2 细菌生长条件的改变对质谱图的影响  29-30
      3.3 MALDI-TOF 质谱技术的检测能力  30
    4 小结  30-31
  第二章养殖场空气中细菌种类及耐药性整体分布情况  31-43
    1 材料与方法  31-34
      1.1 材料  31-32
      1.2 方法  32-34
    2 结果  34-39
      2.1 养殖场空气中细菌分布情况  34-36
      2.2 养殖场空气中细菌耐药情况  36-39
    3 讨论  39-42
      3.1 养殖场空气中细菌分布情况  39-41
      3.2 养殖场空气中细菌耐药情况  41-42
    4 小结  42-43
  第三章养殖场空气中凝固酶阴性葡萄球菌耐药基因检测  43-54
    1 材料与方法  43-45
      1.1 材料  43
      1.2 方法  43-45
    2 结果  45-50
      2.1 CNS对β-内酰胺类抗生素耐药基因mecA的检测结果  45-46
      2.2 CNS对大环内酯类抗生素诱导耐药性检测及耐药基因分布..  46-49
      2.3 四环素类抗生素耐药基因tetK、tetM检测结果  49-50
    3 讨论  50-53
      3.1 凝固酶阴性葡萄球菌对β内酰胺类的耐药特点  50-51
      3.2 凝固酶阴性葡萄球菌对大环内酯类的耐药特点  51-52
      3.3 四环素类耐药基因在凝固酶阴性葡萄球菌中的分布特点  52-53
    4 小结  53-54
  第四章高水平多重耐药鼠鼻罗氏菌的比较蛋白质组学研究  54-74
    1 材料与方法  54-61
      1.1 材料  54-55
      1.2 方法  55-61
    2 结果  61-67
      2.1 鼠鼻罗氏菌鉴定结果  61-62
      2.2 鼠鼻罗氏菌全蛋白SDS-PAGE结果  62-63
      2.3 鼠鼻罗氏菌蛋白双向电泳分离结果  63-64
      2.4 差异蛋白分析结果  64
      2.5 差异蛋白的质谱鉴定及数据库检索  64-67
      2.6 半定量RT-PCR验证结果  67
    3 讨论  67-73
      3.1 双向电泳中的样品制备  67-68
      3.2 利用蛋白质组学技术研究鼠鼻罗氏菌耐药机制的意义  68-69
      3.3 质谱鉴定差异蛋白及RT-PCR的验证分析  69-73
    4 小结  73-74
  参考文献  74-81
第二篇文献综述  81-104
  第一章空气微生物研究进展  81-94
    参考文献  90-94
  第二章畜牧养殖业中抗生素使用现状及存在问题  94-104
    参考文献  101-104
个人简历  104-105
致谢  105

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