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副猪嗜血杆菌神经氨酸酶的序列分析及可溶性表达的研究

作　者: 王旭
导　师: 龙良启; 何启盖; 徐晓娟; 蔡旭旺
学　校: 华中农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 副猪嗜血杆菌 神经氨酸酶 唾液酸 可溶性表达
分类号: S852.61
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


副猪嗜血杆菌(HPS)是猪上呼吸道常在的一种革兰氏阴性菌,在一定条件下能够侵入宿主,引起宿主的格拉瑟氏病(Glasser)。近些年由于养猪规模的扩大和养猪模式的改变,副猪嗜血杆菌对养猪业造成的危害日趋严重,造成了巨大的经济损失。但是人们对于副猪嗜血杆菌毒力因子的研究仍然很少。1997年,Lichtensteiger在90%的副猪嗜血杆菌中检测到了神经氨酸酶的活性,认为神经氨酸酶可能是副猪嗜血杆菌一种极其重要的毒力因子。后来地方分离株SH0165全基因组测序完成后,发现了神经氨酸酶的基因nanH。在关于其他细菌的报道中,神经氨酸酶是一种重要的毒力因子,主要与细菌的营养、粘附与入侵、毒素以及抵抗宿主的先天免疫有关。但是目前副猪嗜血杆菌神经氨酸酶的研究却甚少。本实验以副猪嗜血杆菌nanH为研究对象,对副猪嗜血杆菌不同标准株的神经氨酸酶序列和活性进行分析,同时通过原核表达获得了可溶性表达的有活性的神经氨酸酶。主要包括以下内容：1.不同副猪嗜血杆菌标准株神经氨酸酶的测序及序列分析以副猪嗜血杆菌15种血清型标准菌株基因组为DNA模板,使用引物nanHF/nanHR扩增nanH全基因。nanH基因扩增片段在15株标准血清型菌株中均为2007bp,含有668个氨基酸。核苷酸同源性为99.54%,氨基酸同源性为99.29%。使用神经氨酸酶检测试剂盒检测了13株标准株的神经氨酸酶活性,虽然神经氨酸酶的氨基酸序列在标准株内高度保守,但是不同标准株间神经氨酸酶活性却大不相同,高毒力的血清5型神经氨酸酶的活性大于除血清9型外的其余中低毒力菌株。证明神经氨酸酶与副猪嗜血杆菌的毒力有重要的关系。不同细菌间比较,副猪嗜血杆菌nanH基因与多杀性巴氏杆菌(Pasteurella mμuLtocida)同源性达到60%,与溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica)同源性达到58%,与其他非巴氏杆菌属如产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)同源性达到38%,与索氏梭菌(Clostridium sordellii)同源性达到34%,与鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)同源性达到31%。同时,对副猪嗜血杆菌15种血清型标准菌株nanH基因做进化树分析,发现高毒力菌株的神经氨酸酶亲缘性更接近。2、副猪嗜血杆菌神经氨酸酶结构特点分析首次分析了副猪嗜血杆菌的神经氨酸酶的结构,包含1个RIF功能域和2个Asp-box区,其活性区域包括由Arg163、Arg233构成的精氨酸三联体、Glu148、Tyr267和Asp182；精氨酸三联体与神经氨酸酶底物神经氨酸(Neu5Ac)的羧基相互作用,Glu148保持其中一个Arg的稳定性,保守的Tyr267的作用是发动亲核攻击,而Aspl82可能起到催化的作用。3、NanH的可溶性表达以副猪嗜血杆菌SH0165基因组DNA为模板,以nanHF/nanHR为引物扩增nanH基因,获得2007bp的条带。将获得的片段连接到pET-32a原核表达载体上,转化BL21(DE3)pLysS感受态细胞,挑取阳性克隆18℃过夜培养,集菌破碎后,使副猪嗜血杆菌神经氨酸酶以可溶性表达的形式存在,同时使用神经氨酸酶检测试剂盒检测有活性,为未来研究神经氨酸酶的功能打下基础。

全文目录


摘要  6-8
Abstract  8-10
缩略语表(Abbreviation)  10-11
1. 文献综述  11-16
  1.1 副猪嗜血杆菌研究  11-13
    1.1.1 副猪嗜血杆菌研究概述  11
    1.1.2 副猪嗜血杆菌毒力因子的研究  11-13
  1.2 神经氨酸酶与唾液酸代谢的研究进展  13-16
    1.2.1 唾液酸  13-14
    1.2.2 神经氨酸酶  14-15
    1.2.3 副猪嗜血杆菌唾液酸代谢的研究  15-16
2. 研究目的与意义  16-17
3. 材料与方法  17-32
  3.1 实验材料  17-21
    3.1.1 载体与质粒  17-18
    3.1.2 工具酶及主要试剂  18-19
    3.1.3 主要培养基与抗生素的配制  19-20
    3.1.4 主要缓冲液与试剂及其配制  20-21
  3.2 实验方法  21-31
    3.2.1 副猪嗜血杆菌nanH基因的克隆  21-24
    3.2.2 重组质粒的构建  24-25
    3.2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)  25
    3.2.4 连接产物的转化  25-26
    3.2.5 质粒的制备与鉴定  26-27
    3.2.6 蛋白的原核表达  27-29
    3.2.7 神经氨酸酶试剂盒检测神经氨酸酶活性  29-31
  3.3 神经氨酸酶粘附功能的研究  31-32
4. 结果与分析  32-43
  4.1 副猪嗜血杆菌15个标准血清型神经氨酸酶序列分析  32-34
    4.1.1 nanH全基因的获取与分析  32
    4.1.2 不同血清型间nanH基因比较结果  32-33
    4.1.3 不同细菌间nanH基因序列比较结果  33-34
    4.1.4 测序重组质粒酶切鉴定  34
  4.2 副猪嗜血杆菌不同标准血清型神经氨酸酶活性分析  34-36
  4.3 副猪嗜血杆菌神经氨酸酶结构特点  36-37
  4.4 神经氨酸酶可溶性表达的研究  37-43
    4.4.1 神经氨酸酶基因的克隆  37-38
    4.4.2 重组表达质粒的构建及鉴定  38-39
    4.4.3 SDS-PAGE鉴定  39-40
    4.4.4 原核表达培养基的选择  40-41
    4.4.5 NA活性的标准化  41-43
5. 讨论  43-48
  5.1 副猪嗜血杆菌不同标准株序列和活性分析  43-44
  5.2 神经氨酸酶在副猪嗜血杆菌中的重要性  44-45
  5.3 副猪嗜血杆菌可溶性表达的研究  45
  5.4 唾液酸代谢的研究  45-48
6. 小结  48-49
参考文献  49-54
致谢  54-55
附录：副猪嗜血杆菌15株标准血清型菌株神经氨酸酶氨基酸序列  55-62

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 病原细菌
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