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EV71通过2A蛋白酶切割Nup62而抑制核转运

作　者: 张亚洲
导　师: 李灵敏
学　校: 山西医科大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 肠道病毒71型 Nup62 核转运 2A
分类号: R373.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 20次
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内容摘要

研究目的：研究EV71病毒及其2A蛋白酶对核孔蛋白P62的影响，从而影响核孔复合物的核转运的功能。研究方法：构建带有核定位信号（NLS）的绿色荧光蛋白载体（pGFP-NLS），将此表达载体转染RD细胞24h后，用1TCID50、10TCID50和100TCID50的EV71病毒分别感染细胞，8h后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的定位情况；将EV71的2A蛋白酶的真核表达载体与pGFP-NLS共转染RD细胞，转染48h后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的定位情况；用1TCID50、10TCID50和100TCID50的EV71病毒分别感染RD细胞，8h后收集细胞，裂解细胞后进行Nup62的western blotting检测，同时提取细胞的RNA，逆转录，用EV71-2A的引物进行PCR扩增验证；将2A蛋白酶真核表达载体转染RD细胞，在转染24h、36h和48h后分别收集细胞，裂解细胞后进行Nup62的western blotting检测，同时提取细胞的RNA，逆转录，用EV71-2A的引物进行PCR扩增验证。结果：转染pGFP-NLS载体24h后，用病毒感染8h，由于病毒阻止了绿色荧光蛋白GFP-NLS的核转移，显微镜下观察到使绿色荧光蛋白表达出现滞留于细胞浆中的现象，而未感染病毒的细胞中绿色荧光蛋白表达于细胞核中；将2A蛋白酶的真核表达载体与pGFP-NLS共转染48h后，显微镜下观察到绿色荧光蛋白滞留在细胞浆中，而未转染2A蛋白酶的对照孔内绿色荧光蛋白表达于细胞核内；不同滴度的EV71病毒感染细胞后的western blotting检测到病毒感染的RD细胞中Nup62蛋白的表达下降，并且下降具有病毒毒力依赖性，即随着病毒毒力的增强蛋白表达量随之下降，而且100TCID50的病毒感染导致细胞中的Nup62出现明显的被切割条带，2A的RT-PCR结果也显示出病毒能够在细胞中复制；转染2A蛋白酶分不同时间收集细胞后的western blotting检测到细胞中的Nup62表达下降，其中在48h时最为明显，RT-PCR结果发现2A的表达具有时间依赖性，随着转染时间的延长，mRNA的表达增加，反映2A蛋白酶的表达也增加。结论：本研究证明EV71病毒可通过2A蛋白酶切割核孔蛋白p62，使核孔复合物的结构受到破坏，从而影响其核转运的功能。

全文目录

中文摘要  5-6
英文摘要  6-7
前言  7-9
1. 材料与方法  9-24
2. 结果  24-33
3. 讨论  33-35
4. 结论  35-36
参考文献  36-40
文献综述  40-51
  参考文献  46-51
注释和说明清单  51-52
攻读学位期间发表文章情况  52-53
致谢  53-54
作者简介  54

EV71通过2A蛋白酶切割Nup62而抑制核转运

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