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日本三角涡虫肌肉发生决定因子DjMDF基因的克隆及再生过程中的表达分析

作　者: 王秀丽
导　师: 袁金铎
学　校: 山东师范大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 日本三角涡虫 肌肉发生决定因子 分子克隆 再生
分类号: Q75
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


涡虫，扁形动物门（Platyhelminthes）涡虫纲（Turbellaria）动物。涡虫是真正三胚层动物的开始，有内胚层、外胚层和中胚层以及三胚层分化形成的器官和组织。涡虫再生能力极强，不论是纵切、斜切、横切，甚至将涡虫切割成279段，切割后每一部分都具有再生出所有缺失组织的能力。涡虫强大的再生能力使其成为研究再生机制、细胞分化和模式建成的模式生物。对涡虫的研究多集中于涡虫损伤后神经系统再生机制、体轴重建机制和全能干细胞neoblasts干细胞特性的维持等方面，涡虫肌肉发生过程的分子调控机制研究甚少。脊椎动物、爪蟾、果蝇、线虫、文昌鱼等肌肉发生机制研究较多，研究表明MyoD基因家族在肌肉发生过程发挥重要作用。本文用生物软件MegAlign比对已知MyoD家族cDNA序列保守区，根据比对结果设计基因特异性引物，PCR扩增得到日本三角涡虫肌肉发生决定因子DjMDF保守区cDNA序列。利用RACE技术在已知cDNA片段的基础上，通过向3’端和5’端延伸扩增的方法，获得DjMDF cDNA序列全长。用生物软件推测DjMDF的氨基酸序列，并对该氨基酸序列作序列比对分析和进化分析。在已知的DjMDF cDNA序列基础上设计带酶切位点的引物，用体外转录的方法得到原位杂交的正义探针和反义探针，斑点杂交确定探针使用浓度及抗体使用浓度。整体原位杂交技术检测切割后再生24h、36h、48h、72h、5day、7day、2week的日本三角涡虫DjMDF基因mRNA表达水平的变化，从而确定DjMDF基因在涡虫肌肉发生中发挥作用。日本三角涡虫肌肉发生决定因子DjMDF基因cDNA序列全长为1558bp，包括29bp的5’非编码区，1422bp的开放阅读框（ORF），107bp的3’非编码区（3’-UTR）。根据ORF区序列用Editsequence软件推测出DjMDF编码的蛋白，为474个氨基酸的DjMDF蛋白。该氨基酸序列中230-314位为bHLH结构域中的basic domain，序列中315-366位氨基酸为helix-loop-helix domain。将得到的DjMDF的氨基酸序列与人、小鼠、果蝇、线虫、爪蟾等MyoD家族进行序列比对，结果表明DjMDF与其它MyoD家族成员一样都有一保守的bHLH结构域。由于MyoD家族是通过保守区形成同源或者异源二聚体，结合在靶基因的启动子上发挥功能，调节与肌肉发生相关的基因表达，由此推测进化上保守的DjMDF，与其他MyoD家族一样参与肌肉发生的调控。半定量PCR表明，在切割后再生涡虫中DjMDF表达水平较高，再生初期随时间推移DjMDF表达逐渐上升，再生36h达到最高值，随后DjMDF表达水平逐渐下降，但均高于正常涡虫中该基因的表达水平。整体原位杂交结果表明，DjMDF主要在有肌肉发生过程的细胞或者组织中表达。在再生尾部的头段蓝色信号首先在间质细胞中出现，随再生进行、咽部形成，蓝色逐渐向后集中到咽形成区，也就是DjMDF表达逐渐集中于形成咽的部位；在再生头部的尾端，DjMDF表达类似头段，首先在间质细胞中出现，逐渐向形成咽的区域集中；而在中间片段，蓝色首先在咽部出现，着色清晰、杂交背景低。涡虫是真正三胚层动物的开始，研究涡虫肌肉发生过程中的分子调控机制，对肌肉组织起源与进化的研究，甚至是动物进化过程中中胚层的起源和分化尤为重要。我们克隆得到日本三角涡虫DjMDF cDNA全序列，对该基因编码的氨基酸序列进行序列比对和进化分析，进一步研究DjMDF在涡虫再生中的表达和功能。

全文目录


中文摘要  5-7
Abstract  7-9
第一章 综述  9-24
  1 涡虫简介  9-11
  2 涡虫肌肉研究  11-17
  3 脊椎动物及其他无脊椎动物肌肉研究  17-23
  4 立题依据及意义  23-24
第二章 涡虫的采集与饲养  24-27
  1 涡虫的采集  24
  2 涡虫的饲养  24-27
第三章 涡虫的分子鉴定  27-37
  1 前言  27
  2 实验材料  27-28
  3 实验方法  28-31
  4 实验结果  31-36
  5 讨论  36-37
第四章 涡虫肌肉发生决定因子 DjMDF 基因的克隆与序列分析  37-63
  1 前言  37
  2 实验材料  37-38
  3 实验方法  38-50
  4 实验结果  50-61
  5 讨论  61-63
第五章 涡虫肌肉发生决定因子 DjMDF 基因在再生过程中的表达分析  63-86
  1 前言  63
  2 实验材料  63-68
  3 实验方法  68-75
  4 实验结果  75-84
  5 讨论  84-86
结论  86-87
参考文献  87-94
致谢  94-95
攻读硕士学位期间发表的文章  95

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 分子遗传学
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