学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

microRNA分离制备方法的研究

作　者: 庞鑫
导　师: 廖世奇
学　校: 兰州大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 小鼠肝脏microRNA Poly(A)加尾法 血清MicroRNA 克隆测序
分类号: Q75
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
下　载: 225次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


MicroRNA是一类18-24nt保守的非编码调控RNA家族,在真核细胞中通过与目的mRNAs的结合位点发生互补,进而在翻译水平上调控目的基因的表达。研究表明,microRNA在细胞增殖、分化、凋亡和肿瘤发生发展方面具有重要的调节功能。虽然针对microRNA及其功能的研究数目众多,但是提取分离microRNA的技术仍比较薄弱,尤其是在血清microRNA分离制备方面,需要进一步的探究。本文选取小鼠肝脏和人血清作为样本进行microRNA分离制备方法的研究。首先进行了小鼠肝脏microRNA的分离制备实验。使用RNAiso Plus获得小鼠肝脏总RNA后,采用Poly (A)加尾法进行实验：3’端加上多聚A尾,5端连接一段L2连接子,并使用特异性引物Oligo(dT),通过RT-PCR获得小分子RNA的cDNA文库并克隆测序。结果显示为4条有效序列,比对分析结果如下：1、7号和8号序列为miRBase库中已知序列miR-122的正义链和反义链；2、3号和6号序列在序列库中没有记录,为未知小分子RNA。进而对这2条未知microRNA可能的二级结构进行分析,发现它们均可形成茎环结构,符合microRNA的结构特征。3号和6号序列已经提交注册到GeneBank中,序列注册号为Banklt1498739Seql JQ343827和BankIt1498739Seq2JQ343828。 BLAST比对表明3号序列位于小鼠载脂蛋白B基因上,推测可能参与载脂蛋白B基因的调控；6号序列位于小鼠28S核糖体RNA上,推测可能与核糖体的基因调控相关联。在成功提取小鼠肝脏microRNA的基础上,进行了人血清microRNA分离制备方法的研究。本实验使用RNAiso Plus提取获得人血清总RNA后,采用三种方法进行后续实验：1、Poly (A)加尾法：依据小鼠肝脏microRNA提取分离的方法,获得小分子RNA的cDNA文库后进行克隆测序；2、连接子法：使用T4RNA连接酶,在提取的RNA两端加上L1和L2连接子,并用与连接子互补配对的引物进行反转录获得cDNA文库,克隆测序；3、Dra Ⅰ酶切法：利用Poly (A)聚合酶获得3端加多聚A尾的小片段RNA,经反转录制备cDNA文库,将P16连接子通过T4RNA连接酶连接到序列的3’端,对连接后产物小量扩增后,Dra Ⅰ酶切去除连接子直接与多聚A尾相连的无效连接。PCR扩增后克隆测序。实验结果如下：1、Poly (A)法：PAGE显示在目的条带处(110bp)有明显条带,测序结果为L2连接子与较长的多聚A相连的假阳性结果；2、连接子法：PAGE显示在约90bp处有明显条带,在目的条带处(110bp)并无明显条带,测序结果为L1和L2连接子相连,并未在两连接子中间连上小分子RNA：3、Dra Ⅰ酶切法：PAGE显示在目的条带处(90bp)有明显条带,测序结果为P16与多聚A直接连接的假阳性结果。综上所述,本实验在小鼠肝脏中成功提取到4条microRNA序列,并将两条未知序列提交至GeneBank获得编号。在此基础上,对人血清microRNA提取分离方法进行了初步探索。实验中采用的Poly (A)法、连接子法和Dra Ⅰ酶切法均存在一定的不足,需要进一步的改进。本实验为人血清microRNA分离制备方法的研究奠定基础。

全文目录


相似论文

  1. MBR和常规污水处理工艺中除磷菌种群结构研究,X172
  2. 一组新的桉树EST-SSR标记开发及遗传图谱的整合,Q943.2
  3. 不育男性精子父系及母系印记基因甲基化状态的初步研究,R698.2
  4. 山羊痘病毒P32基因克隆、测序及表达,S852.65
  5. 利用PCR-DGGE研究膜生物反应器中微生物的群落结构,X703
  6. 贫营养条件下微生物代谢产物和生物多样性的研究,X703
  7. 牦牛黑素皮质素受体-4（MC4R）基因的克隆测序及其多态性分析,S823.85
  8. 杏鲍菇和白灵菇的远缘杂交育种研究,S646
  9. 黄杨属部分植物nrDNA ITS序列测定及亲缘关系分析,S687
  10. SRT对微生物代谢产物和生物多样性的影响研究,X703
  11. 猪细小病毒的分离鉴定及NS1基因、VP2基因的克隆测序分析,S852.65
  12. 豫南黑猪与引进猪种FSHβ和PRLR基因多态性及其与繁殖性能的关联性分析,S828
  13. 梅花鹿转化生长因子β_1基因多态与产茸性状的相关性研究,S825
  14. 山羊三种病原特性研究与PCR-RFLP分析,S858.27
  15. MBR中EPS、SMP和生物多样性的研究,X703
  16. 蓖麻毒素基因多样性及其生物学活性的研究,S565.6
  17. Ⅰ型鸭肝炎病毒LY0801株的分离鉴定及致病性研究,S852.65
  18. Ⅰ型鸭病毒性肝炎SG株的致病性研究及全基因组序列测定与分析,S852.65
  19. 鹅催乳素受体基因（PRLR）SNPs检测及其与产蛋量的关系,S835
  20. HBV核苷（酸）类似物多药耐药的检测和分析,R512.62
  21. 广西猪链球菌2型毒力因子的研究,S852.61

中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 分子遗传学
© 2012 www.xueweilunwen.com