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小鼠精子发生相关基因spata3的表达分析

作　者: 李颖
导　师: 郭睿
学　校: 山西医科大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: spata3 精子发生精子细胞变态成形精子领
分类号: Q75
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

研究目的：分析小鼠精子发生相关基因spata3mRNA及其编码蛋白产物的表达特性,揭示该基因在精子细胞变态成形过程中的作用,为深入理解男性不育症的发病机理积累实验室资料。研究方法：1.应用半定量RT-PCR技术分析spata3mRNA的组织表达特异性；2.利用实时荧光定量PCR方法分析spata3mRNA在不同周龄小鼠睾丸组织中的差异性表达；3.通过分子克隆技术构建spata3原核表达载体,并实现spata3在大肠杆菌中的可溶性表达；通过亲和层析纯化获得GST-SPATA3融合蛋白并利用Western blot印迹杂交加以验证；以纯化的融合蛋白为抗原免疫新西兰大白兔,制备抗SPATA3多克隆抗体,ELISA测定抗体效价,Western blot检测抗体特异性；4.利用免疫组织化学染色分析SPATA3蛋白在小鼠曲精小管中的细胞定位；5.利用多重间接免疫荧光技术分析SPATA3蛋白在精子细胞内的亚细胞定位；6.通过免疫共沉淀技术分析SPATA3蛋白与微管蛋白a-tubulin的相互作用。研究结果：1.半定量RT-PCR分析表明spata3mRNA具有显著的睾丸组织特异性表达特征；2.实时荧光定量PCR结果显示spata3mRNA在5周龄及8周龄雄性小鼠睾丸组织中高表达,可能与精子发生后期密切相关；3.酶切图谱分析与DNA序列测定表明spata3原核表达载体构建成功,经诱导表达及亲和层析纯化后获得融合蛋白GST-SPATA3, Western blot印迹杂交证明纯化的重组蛋白具有高度的特异性。ELISA测定显示抗SPATA3多克隆抗体效价可达1:102,400, Western blot显示该抗体可与SPATA3蛋白特异结合,具有识别特异性；4.免疫组织化学染色结果显示SPATA3蛋白在小鼠曲精小管中主要定位在圆形精子细胞和长形精子细胞内；5.多重间接免疫荧光染色分析表明SPATA3蛋白与精子细胞变态成形过程出现的精子领结构共定位在圆形及长形精子细胞核表面,并伴随精子细胞核的改变而出现形态及定位的动态变化；6.免疫共沉淀实验尚未证明SPATA3与a-tubulin能够在体外形成免疫沉淀复合物,需利用其他方法进一步验证。研究结论：1. spata3mRNA在小鼠睾丸组织中高表达,具有显著的组织表达特异性。在5周龄及8周龄小鼠睾丸组织中spata3mRNA处于高水平转录状态,具有显著的阶段特异性表达,提示该基因与精子发生后期过程密切相关；2. SPATA3蛋白定位在圆形精子细胞和长形精子细胞核周,并且与精子领结构在形态改变及发育时间上具有高度的吻合性,提示该蛋白可能与精子领共同参与了精子细胞核的浓缩变形过程；3. SPATA3蛋白与a-tubulin能够在体外形成免疫沉淀复合物,说明二者之间存在一定的相互作用,但仍需进一步证明该作用属直接作用还是间接作用。4.实验证实本课题制备的抗SPATA3多克隆抗体能特异识别细胞内SPATA3蛋白,为后期进一步从蛋白水平研究spata3的功能及作用机制提供了实验材料。

全文目录

中文摘要  6-8
Abstract  8-10
插图、附表清单  10-11
英文名称缩略语  11-13
前言  13-16
第一章实验材料  16-27
  1.1 实验动物  16
  1.2 菌株  16
  1.3 质粒  16-17
  1.4 工具酶及主要试剂  17-18
  1.5 引物  18-19
  1.6 主要仪器及器材  19-20
  1.7 试剂配制方法  20-27
第二章实验方法  27-41
  2.1 小鼠组织总RNA的提取  27
  2.2 半定量RT-PCR分析spata3 mRNA组织特异性表达  27-29
  2.3 实时荧光定量PCR检测spata3 mRNA阶段特异性表达  29-30
  2.4 pMD-19-T-spata3的克隆及鉴定  30-33
  2.5 重组表达载体pGEX6P-1-spata3的构建及鉴定  33-35
  2.6 重组蛋白的诱导表达  35-36
  2.7 重组蛋白的亲和层析纯化  36-37
  2.8 Western blot鉴定纯化蛋白  37
  2.9 Bradford法测定纯化蛋白浓度  37-38
  2.10 多克隆抗体的制备  38
  2.11 ELISA测定血清效价  38-39
  2.12 Western blot检测抗体的特异性  39
  2.13 免疫组化分析SPATA3的细胞定位  39
  2.14 多重间接免疫荧光染色分析SPATA3的亚细胞定位  39-40
  2.15 免疫共沉淀分析SPATA3与α-微管蛋白的相互作用  40-41
第三章实验结果  41-57
  3.1 组织样晶总RNA的提取及鉴定  41
  3.2 RT-PCR验证spata3组织特异性表达  41-42
  3.3 实时荧光定量PCR分析spata3阶段特异性表达  42-43
  3.4 pGEX6P-1-spata3质粒构建过程  43-45
  3.5 spata3编码序列的扩增  45
  3.6 pMD-19-T-spata3质粒的PCR和酶切鉴定  45-46
  3.7 重组表达载体pGEX6P-1-spata3的PCR和酶切鉴定  46
  3.8 DNA序列测定  46-49
  3.9 重组蛋白的诱导表达  49
  3.10 重组蛋白的的纯化和Western blot鉴定  49-50
  3.11 多隆抗体的制备与检测  50-51
  3.12 免疫组织化学检测SPATA3在曲精小管中的细胞定位  51-52
  3.13 多重间接免疫荧光检测SPATA3的亚细胞定位  52-55
  3.14 免疫共沉淀分析  55-57
第四章讨论  57-60
参考文献  60-63
综述  63-75
  参考文献  72-75
个人简介  75-76
致谢  76

小鼠精子发生相关基因spata3的表达分析

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