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瑞氏木霉纤维二糖水解酶基因cbh1和cbh2双敲除菌株的构建

作　者: 王肖燕
导　师: 汪天虹
学　校: 山东大学
专　业: 生物工程
关键词: 瑞氏木霉 多基因敲除 cbh1 cbh2 pyrG
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


瑞氏木霉(Trichoderma reesei)是重要的降解纤维素材料的丝状真菌之一,可以分泌一整套的降解纤维素的酶系。其中外切葡聚糖纤维二糖水解酶的产量最高,占胞外分泌总蛋白的60%以上。瑞氏木霉具有结构简单、生长迅速、操作简便的优点,同时作为真核生物,它又具有真核基因表达和真核蛋白质翻译后修饰加工装置,具有与哺乳动物系统相似的蛋白修饰性能。长期以来瑞氏木霉被用于纤维素酶、半纤维素酶和蛋白酶等多种酶类的生产。近年来,瑞氏木霉已被作为基因工程宿主菌用于生产外源蛋白。瑞氏木霉所具有的优良性能促使了科研工作者对该菌的分子生物学研究和遗传改造。在丝状真菌研究中,由于菌株高效筛选标记的数目有限,难以实现对菌株的多基因连续敲除。因此建立丝状真菌选择标记删除系统有利于对丝状真菌进行多次遗传改造。尿嘧啶营养缺陷型标记具有转化效率高、容易得到转化子等优点,在丝状真菌遗传转化中受到青睐。通过将尿嘧啶营养缺陷型的互补基因pyrG转入相应的营养缺陷型菌株, pyrG基因与受体菌的缺陷基因互补,从而使受体菌表现野生型生长而作为选择标记。构建基因敲除载体时,在标记基因pyrG两侧分别添加一段短的正向重复序列,这样转化子中的pyrG基因可以借助两侧正向重复序列的重组而被删除,然后在添加5-氟乳清酸(5-FOA)的培养基上筛选即可得到不带有标记基因的目的基因敲除菌株。利用该策略在多基因的连续敲除中可以实现选择标记的重复使用而不引入其他标记基因。在基因工程研究中,影响外源蛋白产量的因素包括启动子强度、启动子拷贝数、信号肽及蛋白质稳定性等。另外,内源基因的高效表达可能会影响外源蛋白的产量。有文献报导通过抑制菌体主要内源蛋白的表达有助于提高外源基因的表达量。因此在瑞氏木霉表达外源蛋白时,cbhl、cbh2、egl和eg2等主要内源基因在机体内相对高效的表达势必会影响外源基因的表达。构建瑞氏木霉主要内源纤维素酶基因缺失菌株将有助于提高外源蛋白的表达量,本文工作以此为出发点来展开研究。本文利用重组PCR技术分别构建了以尿嘧啶营养缺陷(pyrG)为选择标记的cbh1基因敲除盒和cbh2基因敲除盒,并在选择标记基因pyrG两侧各添加了一段短的正向重复序列,以保证筛选标记基因的重复利用。分别用cbhl基因敲除盒和cbh2基因敲除盒转化瑞氏木霉Atku70菌株,在基本培养基上筛选得到cbh1和cbh2基因单敲除菌株△cbh1::pyrG+和△cbh2::pyrG+。用5-氟乳清酸(5-FOA)对△cbh1::pyrG进行反筛,得到了不带有标记基因的cbh1基因敲除菌株△cbh1。在敲除cbh1菌株△cbh1的基础上进一步敲除cbh2,构建了cbh1和cbh2基因双敲除菌株△cbh1△cbh2::pyrG+,经过5-氟乳清酸(5-FOA)反筛去除标记基因得到双敲除菌株△cbh1△cbh2。对瑞氏木霉转化子进行了PCR、Southern验证及PAGE分析,实验结果表明基因缺失菌株△cbh1、△cbh2::pyrG+和△cbh1△cbh2构建成功,△cbh1和△cbh1△cbh2菌株已不含有原先转入的筛选标记基因。菌株培养物上清液IAGE电泳结果显示：cbh1缺失菌株△cbh1外切葡聚糖酶Ⅰ的量与出发菌株△tku70相比明显下降,而外切葡聚糖酶Ⅱ的分泌量有所提高；cbh2缺失菌株△cbh2::pyrG+外切葡聚糖酶Ⅰ的量与出发菌株△tku70相比没有太大的变化,外切葡聚糖酶Ⅱ的分泌量有所下降；cbh1/cbh2双缺失菌株△cbh1△cbh2外切葡聚糖酶Ⅰ和外切葡聚糖酶Ⅱ的量与出发菌株△tku70相比均明显下降。本文用现代分子生物学操作技术对瑞氏木霉△tku70菌株进行了有目的的遗传改造,成功的构建了瑞氏木霉cbh1(?)-cbh2基因单敲除及双敲除菌株。研究过程中在标记基因两侧各添加一段短的重复序列从而使标记基因重复利用的策略为多基因的连续敲除提供了一-条行之有效的途径。另外,通过遗传工程策略构建瑞氏木霉纤维素酶系统多基因敲除菌株有助于提高外源蛋白表达量,该工程菌株有酶制剂、食品和化工等产业领域将有很好的应用前景。

全文目录


摘要  7-9
ABSTRACT  9-12
缩略词表  12-13
第一章 绪论  13-21
  1.1 纤维素酶分子生物学研究进展  14-16
    1.1.1 纤维素酶系的组成  15
    1.1.2 纤维素酶降解纤维素的机制  15
    1.1.3 纤维素酶的应用前景  15-16
  1.2 瑞氏木霉纤维二糖水解酶  16-18
    1.2.1 纤维二糖水解酶的结构  16-17
    1.2.2 纤维二糖水解酶的理化性质  17
    1.2.3 纤维二糖水解酶基因与外源基因的表达  17-18
  1.3 丝状真菌基因打靶技术  18-20
    1.3.1 丝状真菌基因打靶技术的限制因素  18
    1.3.2 多基因连续敲除策略  18-19
    1.3.3 丝状真菌基因打靶技术发展  19-20
  1.4 本文研究意义及主要内容  20-21
第二章 瑞氏木霉纤维二糖水解酶cbh1和cbh2基因的单敲除  21-45
  2.1 材料和方法  21-34
    2.1.1 质粒和菌株  21
    2.1.2 主要实验试剂和仪器  21-22
    2.1.3 培养基和培养条件  22
    2.1.4 菌种保存  22-23
    2.1.5 引物设计及PCR扩增条件  23-25
    2.1.6 基因敲除盒的构建  25-27
      2.1.6.1 cbh1基因敲除盒的构建  25-26
      2.1.6.2 cbh2基因敲除盒的构建  26-27
    2.1.7 瑞氏木霉的遗传转化  27-28
      2.1.7.1 瑞氏木霉原生质体的合制备  27-28
      2.1.7.2 瑞氏木霉原生质体质量检测  28
      2.1.7.3 瑞氏木霉原生质体转化  28
    2.1.8 瑞氏木霉染色体提取  28-29
      2.1.8.1 振荡破壁法快速小量提取  28-29
      2.1.8.2 液氮研磨法大量提取染色体  29
    2.1.9 瑞氏木霉转化子的筛选  29-30
    2.1.10 瑞氏木霉转化子的PCR验证  30-31
      2.1.10.1 瑞氏木霉转化子△cbh1::pyrG~+的PCR验证  30
      2.1.10.2 瑞氏木霉转化子△cbh2::pyrG~+的PCR验证  30-31
    2.1.11 瑞氏木霉转化子的Southern blot验证  31-33
      2.1.11.1 探针的制备  31-32
      2.1.11.2 印迹杂交与显色  32-33
    2.1.12 瑞氏木霉转化子的反筛  33
    2.1.13 瑞氏木霉转化子△cbh1的PCR验证  33-34
    2.1.14 瑞氏木霉转化子△cbh1的Southern blot验证  34
  2.2 实验结果和讨论  34-43
    2.2.1 瑞氏木霉cbh1基因的敲除  34-40
      2.2.1.1 cbh1基因敲除盒的构建  34-35
      2.2.1.2 瑞氏木霉△tku70的转化及△cbh1::pyrG~+转化子的筛选  35
      2.2.1.3 △cbh1::pyrG~+转化子的验证  35-37
      2.2.1.4 △cbh1::pyrG~+转化子的反筛  37
      2.2.1.5 △cbh1菌株的PCR验证  37-38
      2.2.1.6 △cbh1菌株Southern blot验证  38-40
    2.2.2 瑞氏木霉cbh2基因的敲除  40-43
  2.3 本章小结  43-45
第三章 瑞氏木霉纤维二糖水解酶cbh1和cbh2基因的双敲除  45-54
  3.1 材料与方法  45-47
    3.1.1 菌株及质粒  45
    3.1.2 主要实验试剂  45
    3.1.3 主要培养基及培养条件  45-46
    3.1.4 本章所用引物  46
    3.1.6 Acbh1菌株的转化及转化子的筛选  46
    3.1.7 cbh1和cbh2基因双敲除转化子△cbh1△cbh2::pyrG~+的验证  46
    3.1.8 瑞氏木霉cbh1和cbh2基因双敲除转化子△cbh1Acbh2::pyrG~+的反筛  46
    3.1.9 △cbh1△cbh2::pyrG~+反筛后菌株△cbh1△cbh2的PCR验证  46-47
    3.1.10 △cbh1△cbh2::pyrG~+反筛后菌株△cbh1△cbh2的Southern blot验证  47
    3.1.11 瑞氏木霉转化子胞外蛋白的SDS-PAGE  47
  3.2 实验结果与讨论  47-52
    3.2.1 cbh2基因敲除盒的构建  47
    3.2.2 瑞氏木霉△cbh1的转化及△cbh1△cbh2::pyrG~+转化子的筛选  47-48
    3.2.3 瑞氏木霉cbh1和cbh2基因双敲除转化子△cbh1△cbh2::pyrG~+的验证  48-49
    3.2.4 瑞氏木霉cbh1和cbh2基因双敲除转化子△cbh1△cbh2::pyrG~+的反筛  49
    3.2.5 △cbh1△cbh2::pyrG~+反筛后菌株△cbh1△cbh2的PCR验证  49-50
    3.2.6 △cbh1△cbh2::pyrG~+反筛后菌株△cbh1△cbh2的Southern blot验证  50-51
    3.2.7 瑞氏木霉转化子胞外蛋白的SDS-PAGE分析  51-52
  3.3 本章小结  52-54
全文总结  54-55
参考文献  55-59
致谢  59-60
攻读学位期间已（待）发表的学术论文目录  60-61
学位论文评阅及答辩情况表  61

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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