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MRG15蛋白与Sedlin蛋白的相互作用研究

作　者: 姜天鹏
导　师: 范礼斌
学　校: 安徽医科大学
专　业: 细胞生物学
关键词: MRG15 酵母双杂交共定位蛋白质相互作用
分类号: Q26
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的研究细胞衰老相关蛋白MRG15（MORF4-Related Gene on chromosome15）与迟发性脊椎骨骺发育不良蛋白Sedlin的相互作用。运用酵母双杂交技术，GSTpull-down技术，免疫荧光技术，免疫共沉淀的方法（co-immunoprecipitation，CO-IP）检测MRG15蛋白和Sedlin蛋白的相互作用。方法采用酵母双杂交技术研究MRG15蛋白和Sedlin蛋白的相互作用，以人MRG15全长cDNA为模板，PCR法扩增人MRG15基因,将片段插入到pGADT7载体中，构建pGADT7-MRG15载体。将其与pGBKT7-Sedlin共同转化酵母菌AH109感受态细胞，SD（﹣Trp/﹣Leu/﹣His/+3-AT）X-α-gal培养基筛选蓝色的阳性克隆。采用GST pull-down方法检测MRG15蛋白和Sedlin蛋白在体外的相互作用。以人MRG15全长cDNA序列为模板，PCR扩增目的基因并在N端加FLAG标签，将带有标签的MRG15基因构建到pcDNA3.1载体上，构建MRG15真核表达载体pcDNA3.1-FLAG-MRG15。将转染pcDNA3.1-FLAG-MRG15的293T细胞裂解液同GST和GST-Sedlin融合蛋白共同孵育2h，GST珠子经洗涤沉淀后加SDS上样缓冲液沸水浴，将裂解液和沉淀物经SDS-PAGE电泳和免疫印迹后显现条带，用GST抗体和FLAG抗体分别印记。比较GST、GST-Sedlin和FLAG-MRG15的相对位置，从而验证在体外MRG15蛋白和Sedlin蛋白的相互作用。采用间接免疫荧光技术（Immunofluorescence technique）检测MRG15蛋白和Sedlin蛋白在哺乳动物细胞中的共定位情况。将pcDNA3.1-FLAG-MRG15和pcDGFP-Sedlin通过脂质体共转染到COS7细胞中，先后孵育一抗、二抗，利用不同标签蛋白在不同激发光下显示不同荧光，观察MRG15蛋白和Sedlin蛋白在COS7细胞中的定位。采用免疫共沉淀的方法检测哺乳细胞内MRG15蛋白与Sedlin蛋白的结合情况。将pcDGFP-Sedlin和pcDNA3.1-FLAG-MRG15共同转染至HEK293T细胞，提取细胞裂解液，用FLAG M2单克隆抗体结合细胞裂解液中的MRG15及其结合蛋白进行免疫共沉淀，通过Western blot法检测在MRG15蛋白与Sedlin蛋白的结合情况。结果酵母双杂交结果表明，共表达MRG15蛋白和Sedlin蛋白两种融合蛋白，细胞表现α-半乳糖苷酶活性，SD培养基上长出蓝色菌落，表明两种蛋白能够相互作用。GST pull-down结果表明，MRG15和GST-Sedlin蛋白在体外能够结合。免疫荧光结果表明了MRG15蛋白主要分布在细胞核，Sedlin蛋白在胞质和细胞核中都有分布，二者在细胞核内有部分共定位。免疫共沉淀的结果表明，在HEK293T细胞中，MRG15和Sedlin能够相互作用。结论以上实验结果表明， MRG15蛋白与Sedlin蛋白可以相互作用，作用区域主要在细胞核内，结果提示Sedlin可能在细胞核中起到重要作用。

全文目录

英文缩略词表  5-7
中文摘要  7-8
Abstract  8-10
1 引言  10-12
2 材料与方法  12-32
3 结果  32-39
4 讨论  39-40
5 结论  40-42
参考文献  42-45
附录  45-46
致谢  46-47
综述  47-52
  参考文献  51-52

MRG15蛋白与Sedlin蛋白的相互作用研究

内容摘要

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