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HRE_2.Grp_（78）嵌合启动子调控VP_3表达进行鼻咽癌5-ALA-PDT/基因治疗的研究

作　者: 李晋芸
导　师: 赵素萍
学　校: 中南大学
专　业: 耳鼻咽喉科
关键词: 鼻咽癌 基因治疗 光动力学治疗 Grp78启动子
分类号: R739.63
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


研究目的:鼻咽癌（NPC,nasopharyngeal carcinoma）是我国南方地区常见的恶性肿瘤,占头颈部恶性肿瘤首位,已严重地危害了人们的生命健康。病理学上95%以上的NPC为非角化癌,对放射治疗中度敏感,因此临床上首选的治疗手段是根治性放疗。虽然近年来随着放射物理学及放射生物学技术水平不断提高,放射技术不断改善。但放射疗效仍差强人意,总的5年生存率仅50-60%左右,且放射损害较大。NPC经第一次放射治疗后,引起局部组织的血管萎缩,导致鼻咽部供血不良,再次放疗的敏感性低、疗效差,且副作用大。鼻咽部部位隐蔽,周围有重要组织器官,手术暴露困难,手术效果不佳。因此NPC放疗后残灶及复发灶的治疗是临床上非常棘手的难题。本课题拟利用光动力治疗方法（PDT）,结合应激敏感的启动子Grp78特异性调控肿瘤凋亡基因VP3的基因治疗NPC,观察该治疗方法对NPC的杀伤效率,探索鼻咽癌的治疗新策略,以提高鼻咽癌的治疗效果。研究方法1)利用PCR,酶切,连接等技术构建并鉴定四种真核质粒表达载体PcDNA3.1（-）Grp78p.VP3-Myc-CMV,PcDNA3.1（-）Hre2.Grp78p.VP3-Myc-CMV,Pc DNA 3.1（-）CMV.VP3-Myc以及PcDNA 3.1（-）VP3-Myc-CMV2)将构建成功的四种真核质粒表达载体瞬时转染至鼻咽癌细胞株CNE-2中,通过RT-PCR,Western-Blotting鉴定凋亡素基因VP3在NPC细胞株中的表达并利用CCK-8法观察VP3对NPC的杀伤作用。3)摸索PDT杀伤鼻咽癌CNE-2细胞的最佳光敏剂浓度,最佳光敏剂孵育时间,以及激光辐射剂量,应用PDT治疗NPC,以不加5-氨基酮戊酸（5-ALA）和不用激光照射做为空白对照,单用5-ALA,单用激光做为阴性对照进行实验。利用CCK-8法观察各组细胞存活率.4)进行PDT联合基因治疗鼻咽癌的体外实验研究,以单用基因治疗,单用PDT治疗作为对照组,利用CCK-8法观察各组CNE-2细胞的存活率;利用Western-Blotting检测各组CNE-2细胞VP3基因表达强度的变化;利用流式细胞仪检测各组CNE-2细胞的凋亡率;利用光镜和电镜观察各组CNE-2细胞形态学的变化。研究结果1)成功地构建了四种重组质粒载体即:PcDNA3.1（-）Grp78p.VP3-Myc-CMV,PcDNA3.1（-）Hre2.Grp78p.VP3-Myc-CMV,Pc DNA 3.1（-）CMV.VP3-Myc以及Pc DNA 3.1（-）VP3-Myc-CMV2)将四种载体成功地转染至CNE-2细胞,在mRNA及蛋白水平检测到VP3基因在CNE-2细胞中均有表达;在转染72小时后,转染Pc DNA 3.1（-）CMV.VP3-Myc的细胞存活率（50.8±1.6）%,明显低于转染PcDNA3.1（-）Grp78p.VP3-Myc-CMV（64.1±1.4）%,PcDNA3.1（-）Hre2Grp78p.VP3-Myc-CMV（62.3±0.8）%和PcDNA3.1（-）VP3-Myc-CMV（95.5±1.0）%细胞的存活率（P＜0.05）。结果提示启动子调控下的VP3基因对CNE-2细胞具有一定的杀伤作用。3)5-ALA与CNE-2细胞培养产生了内源性光敏剂原卟啉（PpⅨ）,PpⅨ均匀分布在CNE-2细胞的胞浆中,胞核区未见分布。5-ALA产生的PpⅨ在孵育6小时后在胞浆的表达强度最高,尤以浓度为1.0mmol/1时为显著。5-ALA介导的PDT对人鼻咽癌CNE-2细胞的杀伤作用随着5-ALA与CNE-2细胞孵育时间延长及5-ALA浓度的增加而增加,在孵育6小时,5-ALA浓度为1.0 mmol/L,激光功率为6.25J/cm2时,细胞存活率为（23.31±1.59）%,而单用激光时细胞存活率为（96.42±1.89）%,单用光敏剂5-ALA时细胞存活率为（97.23±2.01）%。结果提示PDT对鼻咽癌CNE-2细胞有较强的杀伤作用。4)应用PDT联合基因治疗CNE-2细胞后,CNE-2细胞的存活率（18.3±2.7）%明显低于单用基因治疗（74.4±0.9）%和单用PDT治疗（55.0±2.2）%的细胞存活率（P＜0.05）;PDT联合基因治疗后,细胞中VP3基因蛋白表达的强度明显高于单用基因治疗组和PDT组（P＜0.05）;PDT联合基因治疗组内,Grp78p调控的VP3基因蛋白表达的强度明显高于CMV调控的VP3基因蛋白表达强度（P＜0.05）;PDT联合基因治疗后CNE-2细胞的凋亡率（68.3±2.3）%明显高于单用基因治疗（27.8±1.6）%和单用PDT（54.8±3.6）%的细胞凋亡率（P＜0.05）;形态学观察显示PDT联合基因治疗组出现明显的细胞坏死和凋亡。结果提示PDT联合基因治疗对鼻咽癌CNE-2有更强的杀伤作用。研究结论:1)首次成功地构建了含Hre2反应元件,Grp78启动子调控的含VP3基因完整编码序列的去除巨细胞启动子的质粒表达载体2)上游含巨细胞启动子或者Grp78p启动子的真核质粒表达载体转入鼻咽癌CNE-2细胞株后,VP3基因对鼻咽癌细胞有一定的杀伤作用;而不含启动子的载体,VP3基因对细胞无杀伤作用。3)5-ALA介导的PDT对鼻咽癌CNE-2细胞有很好的杀伤作用。4)PDT联合基因治疗较单独的基因治疗或者光动力治疗有更显著的杀伤鼻咽癌CNE-2细胞效应。

全文目录


中文摘要  4-7
英文摘要  7-14
英汉缩写词简表  14-16
前言  16-20
实验流程总图  20-26
第一章:构建真核质粒表达载体PcDNA3.1(-)Grp78p VP_3-Myc-CMV,PcDNA3.1(-)Hre_2.Grp78p.VP_3-Myc-CMV和PcDNA3.1(-)CMV.VP_3-Myc  26-43
  1.1 材料  26-28
    1.1.1 质粒  26-27
    1.1.2 引物  27
    1.1.3 试剂  27
    1.1.4 主要的仪器设备  27-28
  1.2 方法  28-32
    1.2.1 PcDNA3.1(-)Grp78p.VP3-Myc的构建  28-30
    1.2.2 PcDNA3.1(-)Hre2.Grp78p.VP_3-Myc的构建  30
    1.2.3 PcDNA3.1(-)CMV.VP_3-Myc的构建  30-31
    1.2.4 PcDNA3.1(-)VP_3-Myc,PcDNA3.1(-)Grp78p.VP_3-Myc,PcDNA3.1(-)Hre_2.Grp78p.VP_3-Myc的巨细胞启动子的切除  31-32
  1.3 结果  32-40
    1.3.1 Grp78pPCR 产物扩增结果  32
    1.3.2 真核质粒表达载体的CMV的酶切鉴定结果  32-33
    1.3.3 切除巨细胞启动子的PcDNA3.1(-)Grp78p.VP_3的构建  33-35
    1.3.4 切除巨细胞启动子的PCDNA3.1(-)Hre_2.Grp78p.VP_3质粒的测序结果  35-37
    1.3.5 PCDNA3.1(-)VP_3-CMV质粒的测序结果  37-39
    1.3.6 PCDNA3.1(-)CMV.VP_3-Myc质粒的测序结果  39-40
  1.4 讨论  40-42
  1.5 结论  42-43
第二章:VP_3基因对鼻咽癌细胞CNE-2的杀伤作用  43-53
  2.1 材料  43-44
    2.1.1 质粒和细胞株  43
    2.1.2 引物  43
    2.1.3 试剂  43-44
    2.1.4 主要仪器和设备  44
  2.2 方法  44-48
    2.2.1 细胞培养及处理  44
    2.2.2 质粒PGV,PHGV和PVP3的大抽提及纯化  44-45
    2.2.3 将纯化质粒PGV,PHGV和PVP3转染CNE-2细胞株  45
    2.2.4 RT-PCR鉴定目的基因的表达  45-46
    2.2.5 免疫印迹分析检测转染后VP3-Myc的蛋白表达水平  46-47
    2.2.6 细胞存活率测定  47
    2.2.7 统计学处理  47-48
  2.3 结果  48-50
    2.3.1 瞬时转染后CNE-2细胞VP_3基因的RT-PCR的表达结果  48
    2.3.2 瞬时转梁后CNE-2细胞VP_3-myc基因的蛋白表达结果  48-49
    2.3.3 瞬时转染后不同时间CNE-2细胞的存活率  49-50
  2.4 讨论  50-52
  2.5 结论  52-53
第三章:5-氨基酮戊酸介导的光动力对人鼻咽癌CNE-2细胞株的杀伤作用  53-61
  3.1 材料  53-54
    3.1.1 细胞株及培养条件  53
    3.1.2 试剂  53
    3.1.3 仪器  53-54
  3.2 方法  54-55
    3.2.1 细胞培养  54
    3.2.2 光敏剂的准备  54
    3.2.3 细胞处理  54-55
    3.2.4 细胞存活率测定  55
    3.2.5 统计学分析  55
  3.3 结果  55-59
    3.3.1 5-ALA在CNE-2细胞中的定位  55-56
    3.3.2 各组细胞在不同处理条件下的存活率比较  56-59
  3.4 讨论  59-60
  3.5 结论  60-61
第四章:HRE_2.Grp_(78p)嵌合启动子调控VP_3表达结合鼻咽癌5-ALA-PDT/基因治疗的研究  61-79
  4.1 材料  61-62
    4.1.1 质粒和细胞株  61
    4.1.2 主要试剂  61-62
    4.1.3 主要仪器设备  62
  4.2 方法  62-65
    4.2.1 细胞培养  62
    4.2.2 细胞处理  62
    4.2.3 实验分组  62-63
    4.2.4 质粒瞬时转染CNE-2细胞  63
    4.2.5 转染后的光动力治疗  63
    4.2.6 CCK-8比色法测定基因治疗,光动力治疗以及基因联合光动力治疗的存活率  63-64
    4.2.7 Western-blotting检测转染后和转染联合光动力治疗后靶向基因的蛋白表达水平  64
    4.2.8 流式细胞术(FCM)观察基因治疗,光动力治疗以及基因联合光动力治疗的细胞凋亡  64-65
    4.2.9 电镜观察基因治疗,光动力治疗以及基因联合光动力治疗的超微结构  65
    4.2.10 统计学处理  65
  4.3 结果  65-76
    4.3.1 基因治疗,光动力治疗以及基因联合光动力治疗的鼻咽癌细胞CNE-2存活率的比较  65-66
    4.3.2 基因治疗和基因联合光动力治疗后靶向基因的蛋白表达水平情况  66-71
    4.3.3 流式细胞术(FCM)观察基因治疗,光动力治疗以及基因联合光动力治疗的细胞凋亡的结果  71-74
    4.3.4 观察基因治疗,光动力治疗以及基因联合光动力治疗后CNE-2形态学变化  74-76
  4.4 讨论  76-78
  4.5 结论  78-79
总结论  79-80
参考文献  80-89
综述  89-102
致谢  102-104
攻读学位期间主要研究成果  104

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 耳鼻咽喉肿瘤 > 咽肿瘤
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