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清热化湿透表法干预小鼠流感病毒性湿热证免疫损伤的机理研究

作　者: 刘叶
导　师: 钟嘉熙
学　校: 广州中医药大学
专　业: 中医临床基础
关键词: 流感病毒湿热证细胞因子免疫损伤清热化湿透表法
分类号: R254
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
下　载: 252次
引　用: 5次
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内容摘要

研究目的近年来,中医药在治疗病毒性疾病方面逐步体现出独特的优势,特别是中药复方多靶点作用,整体调节机体免疫,达到“祛邪不伤正”的目的。呼吸道病毒感染是岭南地区临床常见病、多发病。病毒学检测发现,成人以流感病毒、副流感病毒感染为主。本病的临床治疗采用辨病与辨证相结合,临证治疗相当灵活。常用的中医治法有清热化湿、清热解毒、益卫固表等,其作用机理与抑制病毒复制、调节机体免疫、减少局部炎症渗出等有关。上述研究加深了对运用中医药治疗呼吸道病毒感染的认识,但还存在不少亟待解决的问题。本病的发生与病毒、机体、环境等多种因素相关,不同治法在疾病的不同阶段发挥作用,如何在治法研究中体现“辨证”的思路,有待进一步探讨。研究表明,岭南地区呼吸道病毒感染从中医辨证具有易化热挟湿的特点。本研究前期的临床调查亦表明急性上呼吸道感染发病初起即易挟湿。清热化湿透表法是该地区常用外感热病治法之一,其中用于气分湿热证的蒿芩清胆汤除了具有清热化湿作用外,方中青蒿更能透邪达表,是清热化湿透表的代表方之一。以该方为主的经验治法广泛应用于岭南地区的呼吸道病毒感染治疗,具有一定地域特点,体现了中医辨证“三因制宜”的思路。为进一步明确岭南地区呼吸道病毒感染湿热证的内涵和外延,探讨清热化湿透表法的作用机理,我们进行了以下研究,以期为临床辨证运用清热化湿透表法治疗呼吸道病毒感染提供理论、临床和实验研究依据。研究方法本研究通过文献回顾及对101例急性上呼吸道感染患者的证候特点及用药特点的观察,在传统湿热证动物模型基础上,采用“肥甘饮食+湿热环境+流感病毒感染”方法,构建小鼠流感病毒性肺炎湿热证模型。以蒿芩清胆汤代表清热化湿透表法,以肺指数初步评价该法的治疗效果,以流式细胞术检测模型小鼠T淋巴细胞CD₃⁺/CD₄⁺,CD₈⁺T亚群变化,以ELISA法检测血清IFN-γ及IL-4水平,通过Th1/Th2类细胞平衡变化评估机体免疫功能,采用免疫组织化学法检测肺组织炎症因子NF-κB及水通道蛋白AQP4的阳性表达,探讨清热化湿透表法干预病毒性肺炎湿热证的作用方向,并与银翘散（辛凉解表法）、玉屏风散（益卫固表法）比较异同。研究结果及分析模型构建方面:①造模成功后,模型小鼠体重减轻、肛温升高,蜷缩懒动、反应迟钝、呼吸急促甚则口唇紫绀,肺组织发生炎性实变。模型鼠症状的出现较单纯病毒感染小鼠滞后,似有减轻趋势。②模型小鼠感染病毒后,T淋巴细胞亚群比例失调,CD₄⁺T%降低,CD₈⁺T%升高,CD₄⁺/CD₈⁺比例倒置,病毒感染造成小鼠免疫系统抑制;致炎因子IFN-γ分泌显著增加,而IL-4分泌水平未见明显变化,Th1/Th2细胞因子平衡向Th1方向偏移,与病毒组相比差异不显著。③模型小鼠肺泡壁细胞核因子-κB（NF-κB）表达增强,水通道蛋白4（AQP4）表达增强,反映局部肺组织炎症及肺水肿等病理变化程度。④综合以上结果说明:生物性致病因子（流感病毒感染成功）是病证结合动物模型形成的关键,湿热状态下病毒感染小鼠存在CD₄⁺/CD₈⁺比例倒置、细胞/体液免疫失衡等免疫功能紊乱、IFN-γ、NF-κB等炎症因子过度表达、肺泡壁细胞水液代谢失调,并造成肺组织病理学改变。症状及病理变化与流感病毒感染关系最为密切,高脂饮食、间断湿热环境应激在一定程度上影响了发病时间、病程及病理变化,可能对证型的发展方向有一定影响。治法研究方面:①本实验中,清热化湿透表法对小鼠流感病毒性肺炎湿热证模型肺指数有一定抑制作用,但是与辛凉解表法、益卫固表法相比无明显的差异;②从免疫平衡角度分析:清热化湿透表法能够提高模型小鼠外周血CD₄⁺T%,降低CD₈⁺ T%,调节细胞免疫,维持免疫平衡,调节Th1/Th2类细胞平衡向Th2方向回归,该作用较益卫固表法作用更明显,而辛凉解表法效果不明显。推测整体增强并调节细胞免疫功能可能是该法抗流感病毒作用机理之一。③从炎症及病理变化角度分析:清热化湿透表法能够明显降低小鼠病毒感染后肺泡表面细胞炎症启动因子NF-κB阳性表达,此与其它两种治法相比有一定差异,推测调整机体细胞/体液免疫、减少致炎因子表达可能是该法的作用机制之一。④此外,模型鼠肺组织AQP4表达异常,清热化湿透表法与辛凉解表法、益卫固表法相比对此干预略有不同,尚不能肯定该治法是通过调节AQP4功能发挥作用的。综上,清热化湿透表法、益卫固表法、辛凉解表法对小鼠流感病毒性肺炎湿热证模型有多方面、多靶点的作用机制。其中清热化湿透表法在增强细胞免疫、调节Th1/Th2细胞平衡、降低炎症启动因子方面具有优势。对于复合湿热因素后造成的小鼠流感病毒性肺炎,三种治法均能有效降低肺指数,减轻病变程度。蒿芩清胆汤、玉屏风散能够更明显地增强机体T细胞免疫功能,调节Th1/Th2类细胞平衡向Th2方向回归。而银翘散则主要从抑制炎症、减轻肺水肿方面起作用。结论综上所述,岭南地区急性呼吸道感染者辨证以风温为主,证候多挟湿,辨病与辨证结合,因地制宜采用综合治法治疗呼吸道病毒感染具有一定优势。以病毒感染结合饮食、环境构建湿热证模型中,病毒感染引起机体免疫功能紊乱是模型成功的关键,湿热状态下病毒感染小鼠存在免疫功能紊乱、炎症因子过度表达、水液代谢失调及病理改变（湿热共同的靶点）。以蒿芩清胆汤为代表的清热化湿透表法能有效降低肺指数,减轻病变程度,与益卫固表法（玉屏风散）、辛凉解表法（银翘散）相比差异不明显。但与其它两种治法相比,该法在调节机体T细胞免疫,调整Th1/Th2细胞平衡,抑制炎症因子表达等环节具有一定优势。提示该法的调节免疫、抑制炎症启动因子的表达等可能是与益卫固表法（增强免疫）及辛凉解表法（抗病毒、抗炎）不完全相同的作用靶点。本研究为呼吸道病毒感染辨证从湿热论治提供了临床和实验室依据。

全文目录

中文摘要  3-6
Abstract  6-11
引言  11-13
第一部分理论研究及前期基础  13-44
  第一章急性呼吸道病毒感染的中医治法研究进展  13-20
  第二章岭南呼吸道病毒感染与湿热的相关性  20-23
  第三章清热化湿透表法的渊源及临床应用  23-28
  第四章现代医学对病毒性肺炎的认识  28-33
  第五章 101例成人急性上呼吸道感染患者的证候学总结及用药分析  33-37
  第六章研究基础及立题思路  37-44
第二部分实验研究  44-73
  第一章小鼠流感病毒性肺炎湿热证模型的构建  44-58
    实验一流感病毒甲1型FM_1株传代与病毒滴度的测定  44-47
    实验二内外湿热造模方法及病毒感染量选择  47-51
    实验三小鼠流感病毒性肺炎湿热证模型的建立  51-56
    小结  56-58
  第二章清热化湿透表法干预模型鼠免疫损伤的机理研究  58-73
    实验四病毒感染确定及清热化湿透表法对模型鼠肺指数的影响  58-62
    实验五清热化湿透表法对模型小鼠T淋巴细胞亚群的影响  62-64
    实验六清热化湿透表法对模型小鼠炎性因子及Th1/Th2细胞平衡的影响  64-67
    实验七清热化湿透表法对模型小鼠肺组织NF-κB阳性表达的影响  67-70
    实验八清热化湿透表法对模型小鼠肺组织AQP4阳性表达的影响  70-73
第三部分分析讨论  73-79
  第一节小鼠流感病毒性肺炎湿热证模型探讨  73-74
  第二节清热化湿透表法干预模型小鼠组织损伤的可能作用方向  74-79
结语  79-81
参考文献  81-88
附录1 大体病变及HE染色病理切片  88-89
附录2 各组小鼠肺组织NF-κB的阳性表达  89-91
附录3 各组小鼠肺组织AQP4的阳性表达  91-93
附录4 缩略词表  93-94
附录5 课题来源、发表论文及获奖情况  94-95
致谢  95

清热化湿透表法干预小鼠流感病毒性湿热证免疫损伤的机理研究

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