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次声治疗对人淋巴瘤Raji细胞与外周血淋巴细胞的影响

作　者: 范建中
导　师: 张积仁
学　校: 第一军医大学
专　业: 肿瘤科
关键词: 次声 Raji细胞人外周血淋巴细胞细胞膜
分类号: R733.1
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

次声是频率在0.0001～20Hz之间的机械振动波。次声波在疾病诊疗方面的巨大开发潜力已日益受到国内外学者的重视。但国外文献的报道中,次声多用于对疼痛性疾病的辅助治疗。但能否用于肿瘤患者及其所致合并症（如癌性疼痛等）,尚未见相关研究报道。次声治疗对肿瘤影响的相关研究尚处于实验探索阶段,除国外个别细胞学研究报道外,国内尚未见次声治疗仪对离体肿瘤细胞、对离体人淋巴细胞作用的研究报道。而此类基础研究对于次声在肿瘤患者中的应用的安全性问题是必须的。以往关于次声所致生物学效应的报道,多为自然界次声以及实验室次声仓内作用条件下的结果;而所谓“安全范围内”已应用于临床治疗的次声治疗仪的具体参数的研究、对治疗用次声发生装置的研究,国内外尚鲜见相关的研究报道:而这是研制次声治疗仪或采用此类装置进行实验以及临床应用的基础。在次声生物学效应的研究方面,我们已经进行了相关的实验工作。在“加味补阳还五汤对次声的防护作用”的研究中,采用加味补阳还五汤作为对次声的防护因子,观察次声作用小鼠（分为正常对照组,次声对照组,次声加用药组）14d后学习记忆成绩、大脑组织的抗氧化物水平（以MDA含量、GSH—Px活性以及SOD活性为指标）及大脑皮层的超微结构变化。结果显示,次声暴露后可以给小鼠造成一定的损伤,主要表现在学习记忆成绩下降,体内MDA含量增加,大脑皮层的神经元、细胞器、毛细血管、髓鞘出现损伤,并伴有脂褐素的出现;治疗性用加味补阳还五汤可通过增强体内SOD及GSH—Px活力清除体内产生过量的自由基,降低脂质过氧化程度,使体内MDA含量下降,还可以减轻大脑皮层的损伤来提高小鼠的学习记忆成绩,不同剂量的防护效果相应的有所不同。我们还采用INFRASOUND 8^TM次声治疗仪直接作用于离体培养的HL-60细胞（作用组）,对照组细胞暴露在空气中,分别在实验处理的1 min、30min、60min、90min和120min取样检测,以台盼蓝活细胞计数,MTT比色法及流式细胞仪技术作为观察指标,证实治疗剂量的次声处理对HL-60细胞的生长无明显影响。本研究拟在探明次声治疗仪所发生的次声信号物理参数的基础上,探讨治疗用次声对人淋巴瘤Raji细胞及健康人外周血淋巴细胞的生物学效应,为次声治疗在肿瘤患者中的应用以及对机体淋巴细胞的影响提供实验参考。1.治疗用次声发生装置声场特征研究1.1材料与方法:美国Chi公司的INFRASOUND 8^TM次声治疗仪作为次声信号源发生装置;采用第四军医大学等单位研制的“次声信号测试分析系统”对声波信号进行分析;将次声信号采集分析系统的传感器探头对准次声治疗仪的声头中央,传感器探头与声头之间的测试距离＜1cm;采样时间点为次声治疗仪工作后第5min后开始:对不同模式（次声治疗仪的1、2、3三个档位）的工作状态下的次声信号进行采集;采用连续测试60s,次声截取频率为:20Hz、16Hz、12Hz、8Hz、4Hz;在对20Hz以下的声压级实时分析的基础上,截取本底噪音最小的15s,从其中每隔0.2s截取瞬间次声信号的相关参数:对收集到的次声信号的频率（Hz）、主频成份（%）、声压等参数进行记录并分析结果。1.2结果:次声治疗仪发生的次声信号特征:各个档位工作时的次声信号声强级均小于90dB,各个档位各频段次声强度按档位大小排列;次声频谱能量主要集中在4Hz、8Hz、12Hz、16Hz和20Hz,各个档位所测得次声的频谱能量比较集中的部分各有不同;而20Hz以上的声波信号（非次声信号）产生也占有相当比例;次声主频信号的频谱是无序变化的,即任何一频段的次声信号都有极低值和最高值的时刻。1.3结论:该次声发生装置工作时的声场分布特征的意义在于:可避免过大的生物共振造成损伤,以保证其治疗过程的安全性;不同档位的不同声场特征可能有不同的临床治疗作用。2.次声对人B细胞淋巴瘤Raji细胞的影响2.1材料与方法:美国Chi公司的INFRASOUND 8^TM次声治疗仪作为次声信号源发生装置;常规培养Raji细胞于含10%灭活胎牛血清的RPMI—1640培养液中;次声组,培养皿置于超净台中的次声治疗仪下,发射头距液面均为1.5cm～2cm,使用次声治疗最高档位3;对照组,次声治疗仪处于关机状态,其余处理同次声组;分别进行实验处理15、30、60、90、120min;分别培养24、48h分别进行检测;实验重复3次。观察指标包括:台盼蓝染色法观察细胞存活状况;噻唑兰染色法（MTT法）测试细胞增殖活性;流式细胞术（Annexin V-EGFP/PI法）观察细胞凋亡情况:扫描电镜观察细胞膜的变化。2.2结果:台盼蓝染色法检测结果显示,实验处理后即刻,在相同处理时间次声组与对照组比较,活细胞数差异无统计学意义（P值均大于0.05）,提示次声处理对Raji细胞无即刻杀伤效应。在次声处理120min后的24h,“活细胞”（台盼蓝拒染细胞）数略低于相应的对照组,但其差异无显著性（P＞0.05）,;次声处理90、120min后的48h,“活细胞”（台盼蓝拒染细胞）也略低于相应的对照组,其差异也无显著性（P＞0.05）,其余处理时间的次声组与对照组之间的差异无显著性（P＞0.05）;MTT法检测结果显示,尽管各次声组的OD值较相应的对照组略有下降的趋势,但其差异均无统计学意义（P＞0.05）;AnnexinV-EGFP/PI双染结果显示,检测细胞样本中活细胞均为90%以上各组的坏死细胞（UL）、各期凋亡细胞（LR、UL）比率均小于10%,且各组总体差别不大;扫描电镜观察结果显示,经次声处理120min/培养24h的细胞形态完整,但细胞表面突起和微绒毛减少或变短明显,正常的突起明显变短、凹陷变浅,细胞表面光滑,个别细胞表面出现晰出物,有可能为凋亡小体脱落。2.3结论:本实验采用的次声处理对Raji细胞的生长及凋亡影响不明显;但可对细胞膜的超微结构产生直接作用,这种作用可能会影响细胞膜的通透性。3.次声治疗对健康人外周血淋巴细胞的作用3.1材料与方法:每个健康志愿者为1例样本,共18例（n=18）,按照实验处理方法分为:次声组（次声处理）、对照组（处理同次声组但次声治疗仪处于关闭状态）、空白组（淋巴细胞分离后一直置于5%CO2饱和湿度的培养箱内培养）;实验处理15、30、60、90、120min,每时间段依次取样后放入5%CO2饱和湿度的培养箱内进行培养。培养24h、48h,检测相关指标,包括:台盼蓝染色法、、噻唑兰染色法（MTT法）、流式细胞术以及扫描电镜的检测。3.2结果:分离后的淋巴细胞存活率达到95%以上,采用MTT法检测的结果显示,实验处理后培养24、48h,次声组的OD值与对照组之间的差异均无统计学意义（P＞0.05）;但次声组OD值随处理时间呈依次增大趋势,而对照组这种趋势不明显。流式细胞仪检测结果显示,各次声处理组与相应的对照组比较,凋亡细胞以及其他各类细胞的比率,其差异性均无统计学意义（P值均大于0.05）。扫描电镜下结果显示:次声处理作用120min/培养48h在细胞的大小、形状、表面微绒毛疏密程度与空白组差异不大;而对照组细胞却有细胞表面微绒毛减少、异形细胞增加等变化。3.3结论:本研究采用的次声治疗剂量对健康人外周血淋巴细胞的细胞活性可能有一定促进作用,但对其凋亡率影响不大;次声处理可能会影响细胞膜的超微结构变化（扫描电镜结果）;次声处理过程可能对淋巴细胞的自然老化过程和外界损害因素的影响有延缓作用;次声所致的淋巴细胞膜超微结构的改变或生物膜通透性的变化可能是其对淋巴细胞的生物学效应的机制之一。4.总结INFRASOUND 8^TM次声治疗仪发生的次声信号特征:各个档位工作时的次声信号声强级均小于90dB,各个档位各频段次声强度按档位大小排列;次声频谱能量主要集中在4Hz、8Hz、12Hz、16Hz和20Hz,各个档位所测得次声的频谱能量比较集中的部分各有不同;次声主频信号的频谱是无序变化的,即任何一频段的次声信号都有极低值和最高值的时刻;本研究采用的信号源是以20Hz以下的声波信号为主（＞69%）的次声信号。该治疗仪对离体培养的Raji细胞的增殖以及凋亡的影响不明显,但较长时间的次声作用可对Raji细胞的细胞膜超微结构有一定影响:对健康人外周血淋巴细胞的细胞活性可能有一定促进作用,但对其凋亡影响不明显,次声可导致淋巴细胞膜超微结构的改变;次声处理过程可能对淋巴细胞的自然老化或凋亡过程和外界损害因素的影响有延缓作用。本研究提示,INFRASOUND 8^TM次声治疗仪对Raji细胞、健康人外周血淋巴细胞的生物学效应可能与次声对细胞膜超微结构的直接作用有关,次声对肿瘤细胞和正常细胞的作用是否有区别（即次声作用的细胞选择性）有待进一步研究。

全文目录

摘要  3-8
ABSTRACT  8-17
前言  17-29
  1. 次声的概念  17-18
  2. 次声的测量  18-19
  3. 对次声生物学效应的研究概况  19-23
  4. 次声治疗与肿瘤  23
  5. 我们已进行的研究工作  23-27
  6. 本研究的目的以及论文提交的研究内容  27-29
第一章治疗用次声发生装置声场特征研究  29-36
  1.1 材料和方法  29-30
  1.2 结果  30-33
  1.3 讨论  33-34
  1.4 小结  34-36
第二章次声对人B细胞淋巴瘤Raji细胞增殖的影响  36-53
  2.1 材料及方法  36-38
  2.2 结果  38-49
  2.3 讨论  49-52
  2.4 结论  52-53
第三章次声对人外周血淋巴细胞的影响  53-66
  3.1 材料及方法  53-55
  3.2 结果  55-63
  3.3 讨论  63-64
  3.4 结论  64-66
全文总结  66-67
参考文献  67-73
缩略词表  73-74
统计分析过程及结果  74-132
综述  132-134
在读期间发表的论文  134-136
致谢  136-138

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