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变应性鼻炎及其合并哮喘者差异基因表达谱的研究

作　者: 薛金梅
导　师: 赵长青
学　校: 山西医科大学
专　业: 耳鼻咽喉-头颈外科
关键词: 变应性鼻炎变应性哮喘寡核苷酸微阵列分析基因表达谱数据挖掘
分类号: R562.25
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

随着全球经济的发展和医学科学的发展,在过去的20-30年间,变应性鼻炎(allergicrhinitis,AR)等变应性疾病的发病率急剧上升,已成为全球性健康问题。世界卫生组织(WHO)、世界过敏组织(WAO)在2005年将每年的7月8日确定为“世界过敏日”(WorldAllergy Day)。哮喘是AR最重要,最常见的并发症,AR合并哮喘发生将严重影响患者生存质量(quality of life,QOL)。文献报道约1/3的变应性鼻炎患者与支气管哮喘常同时或先后出现,部分患者先有鼻炎,数年后出现哮喘,部分患者鼻炎和哮喘基本同时出现,部分患者先有哮喘,而后出现鼻炎,后者多见于儿童。近年来对AR与哮喘的发病机制中基因调控问题的深入研究,使人们逐步认识到AR合并哮喘的发生受到多种因素的调控,是多种生物分子和信号通路在时间和空间上复杂作用的结果,但传统的研究方法一次只能检测一个或几个基因,不仅费时、效率低,而且可比性亦较差。上世纪90年代中期发展起来的高通量的基因芯片技术可同时对数以万计的基因进行快速而准确的检测,有效避免和弥补了传统技术的不足,结果客观可信。其中的表达谱芯片是应用最为广泛的基因芯片。基于此,本研究利用Affymetrix公司的人类全基因组芯片HU-U133-PLUS 2.0对SAR及SAR合并哮喘患者鼻黏膜行差异基因表达谱的研究,并将其作为研究变应性鼻炎并发哮喘的基因调控机制的重要切入点。研究分为两部分,主要结果和内容如下:一基因芯片构建及筛查变应性鼻炎(AR)及其合并哮喘者的基因表达谱1.选择基因芯片待检测标本(AR及AR合并哮喘者下鼻甲黏膜)及标本的总RNA提取、质检严格按照变应性鼻炎的诊断标准采用1997年海口会议制定的标准;支气管哮喘的诊断标准采用1997年制定的“支气管哮喘防治指南”的诊断标准;选取临床病例。同时RIZOL法提取SAR及SAR合并哮喘下鼻甲黏膜的总RNA,经1.2%甲醛变性胶电泳鉴定RNA完整性,试剂盒纯化RNA。结果表明入选临床病例均符合相关疾病诊断标准且为特应性体质。RNA甲醛电泳显示28S、18S两条rRNA条带,且28S明显亮于18S,OD260/OD280≥2.0,表明从下鼻甲黏膜标本中成功提取RNA。2.Affmetrix基因芯片技术研究变应性鼻炎及其合并哮喘者的表达谱将下鼻甲标本的RNA反转录为双链cDNA,再次转录为cRNA并以生物素标记和片段化,与预制的Affymetrix人基因组U133Plus2.0(GeneChip Human U133Plus2.0)基因芯片杂交、并进行芯片扫描和分析,部分差异基因用实时RT-PCR验证结果。发现在所有检测54675个探针(47,000个转录本)中,SAR标本检测到24924个转录本,表达基因检出率为45.2%,SAR合并哮喘标本检测到22002个转录本,表达基因检出率为40.2%,两张芯片表达基因检出率均在40%～50%之间,在哺乳动物中,一般认为在正常的细胞活动中,只有不到50%的基因是表达的(Genome Res,2005,15:443-450)。对于全基因组规模的表达谱基因芯片,一般能检测到40—50%基因是有表达的,表明芯片检测的灵敏度很高。Signal Log Ratio栏中的值≥1或≤-1,代表信号强度之间的差异至少2倍。本研究设定差异至少2倍以上有意义,可得差异表达的基因共有1900个,其中有849个基因,表达上调,1051个表达下调。二对SAR极其SAR合并哮喘者差异基因行分子生物信息学分析3.SAR及其合并哮喘者差异基因的GO功能分类和生物通路(pathway)分析利用GeneSpring软件,依据Gene Ontology数据库对AR及其合并哮喘者的2倍以上、4倍以上差异表达基因进行GO分类;依据KEGG数据库、GenMapp数据库分别对2倍以上差异基因及差异最显著的前十个基因行生物通路pathway分析。结果显示2倍以上差异基因基因主要与细胞代谢、基因转录、细胞增殖、信号转导、免疫应答、多种酶活性、膜受体结合活性、细胞结构蛋白活性等相关;根据KEGG数据库对差异表达2倍以上的基因分析其生物通路(pathway)分析得到:1900个基因分成161类,其中,包含20个以上基因的种类有:参与细胞因子受体间相互作用基因有40个、局部黏附基因28个,细胞黏附分子26个,参与细胞骨架肌动蛋白调节的基因26个,参与细胞间信号传递基因24个,缝隙连接相关基因23个,参与促分裂原活化蛋白激酶信号传导通路基因23个,钙相关信号传导通路23个,白细胞跨膜转运相关基因21个,参与嘌呤代谢基因20个。在所有pathway中,最为引人的是炎症反应途径(Hs_Inflammatory_Response_Pathway);在对上调、下降表达差异最大的十个基因分析得出:两下调基因TEKT1(SLR=-7.2,即130多倍)、AKAP14(SLR=-6.7,即100多倍)均与鼻黏膜纤毛活性、运动相关;RAF1参与丝裂原活化蛋白激酶(MAPK signaling pathway)信号传导通路。4.鼻黏膜SCCA1、SCCA2表达水平有望成为变应性鼻炎并发哮喘的相关生物标记对差异表达基因结合GeneCard数据库、pubmed-NLM文献数据库进行数据挖掘(datamining)。结果显示在GeneCard数据库中查到与哮喘相关基因354个,变应性鼻炎相关基因45个,变应性哮喘(allergic asthma)相关基因13个,结合芯片差异表达基因和pubmed-NLM文献数据库示鳞状上皮细胞癌抗原SCCA1(SERPINB3)、SCCA2(SERPINB4)表达升高与SAR并发哮喘相关。以上研究结果表明SAR合并哮喘的发生和发展,存在多基因表达调控的改变,对其差异基因表达谱的研究有助于阐明变应性鼻炎合并哮喘的发生发展机制,并有利于发现一些未知的与新基因功能潜在相关的信号通路,另外对成人SAR和SAR合并哮喘者的差异基因表达谱的构建以及相关信号传导通路的逐渐明晰,为成人SAR与SAR合并哮喘基因表达数据库和AR相关疾病基因网络学说的建立提供了重要的数据。评估基因芯片检测结果的可靠性及其价值,除了从靶样品的质量与数量、芯片检测与验证技术、数据挖掘策略与方法三个方面来考察,还应充分考虑基因表达的选择性、时空性和非最终性。因为,mRNA的表达水平并不完全等同于蛋白质的表达水平(蛋白质表达水平也只是代表蛋白质的存在及其量的差异),基因表达的最终结果要看其编码的蛋白质的功能状态。总之,对mRNA水平的表达差异应有全面、合理、客观的认识和解释。本研究的一些结果还需大样本、多水平的临床验证。

全文目录

中文摘要  6-9
英文摘要  9-12
前言  12-15
  参考文献  13-15
第一部分:基因芯片构建及筛查变应性鼻炎及其合并哮喘者的基因表达谱  15-47
  研究一、选择基因芯片待检测标本及标本的总RNA提取、质检  15-24
    一、材料与方法  16-19
      1.病例选择及取样  16
      2.主要试剂  16-17
      3.主要溶液及配制  17
      4.主要设备  17
      5.总RNA的提取与纯化  17-18
      6.纯化后的总的RNA的定量和检测  18-19
    二、结果  19-20
      1.临床过敏原皮肤测试结果  19
      2.总RNA电泳检测  19
      3.纯化后总RNA的纯度和定量测定  19-20
    三、讨论  20-21
    附:变应性鼻炎、支气管哮喘诊断标准  21-22
      1.变应性鼻炎诊断标准  21-22
      2.支气管哮喘诊断标准  22
    参考文献  22-24
  研究二、Affmetrix基因芯片技术研究变应性鼻炎及其合并哮喘者的表达谱  24-47
    一、材料与方法  24-33
      1.材料  24-27
      2.方法  27-33
    二、结果  33-45
      1.由总RNA反转录成双链cDNA电泳  33-34
      2.纯化后的cDNA体外转录成cRNA  34
      3.评估Test3Array,Real chip的质量控制  34-35
      4.SAR、SAR合并哮喘下鼻甲标本Affmetrix芯片结果  35-43
      5.基因芯片结果的RT-PCR验证  43-45
    三、讨论  45-46
    参考文献  46-47
第二部分对AR极其AR合并哮喘者差异基因的分子生物信息学分析  47-132
  研究三、AR及其合并哮喘者差异基因的GO功能分类和生物通路(pathway)分析  48-127
    一、材料与方法  48-66
      1.材料  48-49
      2.方法  49-66
    二、结果  66-124
      1.GO功能分类  66-116
      2.对差异表达2倍以上的基因根据KEGG数据库分析其生物通路(pathway)，如下表(tab le8)  116-122
      3.对SAR合并哮喘较SAR者差异最显著的十个基因分析结果：(tabIe 9a、9b)  122-124
    三、讨论  124-126
    参考文献  126-127
  研究四、鼻黏膜SCCA1、SCCA2有望成为变应性鼻炎并发哮喘的相关生物标记  127-132
    一、材料与方法  127
    二、结果  127-130
    三、讨论  130-131
    参考文献  131-132
小结  132-133
本研究存在的问题与后续研究计划  133-134
综述:基因芯片概述  134-141
个人简历  141-142
致谢  142

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