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普通小麦及其近缘种LMW-GS的鉴定、编码基因克隆与进化分析

作　者: 姜程曦
导　师: 姚大年；晏月明
学　校: 安徽农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 小麦 低分子量谷蛋白亚基 SDS-PAGE 分子克隆 分子进化
分类号: S512.1
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


小麦贮藏蛋白是影响小麦品质的主要蛋白,主要包括醇溶蛋白和谷蛋白。谷蛋白主要由高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)和低分子量谷蛋白亚基(LMW-GS)组成。HMW-GS与LMW-GS的含量及组成可直接影响小麦面粉的加工品质。本研究以普通小麦及其近缘种为材料,利用SDS-PAGE技术通过对它们中LMW-GS的分离和鉴定,设计等位基因特异PCR(AS-PCR)引物,对其编码基因进行分子克隆、序列测定与分析,预测LMW-GS的二级结构特征,分析贮藏蛋白基因家族的分子进化关系。为利用基因工程改良小麦品质提供参考依据,为进一步探讨小麦起源与进化奠定基础。1.普通小麦及其近缘种中LMW-GS的分离鉴定和基因克隆用SDS-PAGE对16份普通小麦及其近缘种材料的LMW-GS进行分离鉴定。结果表明,LMW-GS在SDS-PAGE图谱上主要分为B亚基和C亚基两大区域,D亚基在部分品种中存在。根据LMW-GS编码基因5’和3’端的保守序列,设计了5对特异性引物,分别以面包小麦(Acbarrie和Trenton)、野生二粒小麦(Y19和Y21)、栽培一粒小麦(U7)、卵穗山羊草(P1287737、P1361880、P1573408、P1574475和P1573409)、高大山羊草(P1604122、P1604110和P1604108)和茹可夫斯基小麦(P1352553、P1355706和P1355707)的基因组DNA为模板进行扩增,均获得了较明显的扩增条带,然后分别回收并克隆到T-Easy载体上,测序后得到23个新LMW-GS基因,已分别命名并登录GenBank。2.普通小麦及其近缘种LMW-GS基因的序列特征分析基因TreLMW-ml和基因TmLMW-il(部分序列)包括上下游及开放阅读框,基因序列全长分别为1509bp和1274bp。上游序列中存在一些LMW-GS基因的较保守的特征序列,有TATA框,CAAT框和胚乳框,它们对基因表达有着重要的作用。基因TreLMW-ml上游为386bp,有两个TATA框,分别在-76到-71,-59到-54两个位置上。TmLMW-il基因(部分序列)上游为375bp,有两个TATA框,分别在-79到-74,-62到-57两个位置上,二者均有一个CAAT框在-10到-6的位置上。一个胚乳框在基因的-305到-279位置上,序列为ACATGTAAAGTTAAT AAGGTGAGTCAT。基因TreLMW-ml和基因TmLMW-il(部分序列)的下游序列长度均为193bp,保守位置上含有序列为AAATAAA的多腺苷酸化信号,均分别位于终止密码子下游72到77,130到136,141到147这三个位置上。基因TdLMW-ml、TzLMW-m2、AlLMW-m2、TzLMW-ml、AlLMW-ml、TreLMW-ml、AgLMW-ml、AgLMW-m2、AgLMW-m3、AgLMW-m4、AgLMW-m5、AgLMW-m6的编码区大小分别为1056bp、1056bp、1050bp、843bp、846bp、927bp、906bp、903bp、903bp、903bp、912bp、903bp,其中TdLMW-ml、TzLMW-m2、AlLMW-m2、AlLMW-ml、TreLMW-ml、AgLMW-ml、AgLMW-m2、AgLMW-m6、AgLMW-m3、AgLMW-m4都由两个连续终止密码子TGA和TAA终止编码,分别编码350个、350个、348个、280个、307个、300个、299个、299个、299个和299个氨基酸,TzLMW-ml、AgLMW-m5分别由一个终止密码子TGA终止编码,各编码280个、303个氨基酸。根据推导出的氨基酸序列,计算出成熟蛋白质的分子量,分别为37.8KD、37.7KD、37.4KD、31.8KD、31.8KD、32.8KD、31.7KD、31.6KD、31.8KD、31.6KD、31.9KD、31.8KD。因此推测这12个基因编码的蛋白质均为C亚基。通过序列特征分析,它们均为LMW-m型。基因AgLMW-il的编码区为954bp,由两个连续的终止密码子TGA及TAA终止编码,编码316个氨基酸。根据推导出的氨基酸序列,计算出成熟蛋白质的分子量为34.2KD。因此推测这个基因编码的蛋白质为C亚基。通过序列特征分析,它为LMW-i型。其中AgLMW-il具有Ⅰ型、含有9个半胱氨酸残基、含有一条连续27个Q的寡聚谷氨酰胺链等特征,与小麦加工品质正相关,可能为候选的优质基因。由于在连入T-Easy载体的过程中,基因内部序列部分丢失,基因TmLMW-il编码区内只获得了部分序列。通过序列特征分析,它为LMW-i型。基因AcLMW-sl编码区大小为1074bp,由两个连续TAA终止密码子终止编码,编码356个氨基酸。根据推导出的氨基酸序列,计算出成熟蛋白质分子量为38.3KD,因此推测此基因编码的蛋白质为C亚基。通过序列特征分析,它为LMW-s型。基因pAlLMW-il、pTzLMW-il、pTzLMW-i2、pAgLMW-ml、pAgLMW-il、pAgLMW-i2、pTreLMW-il和pTmLMW-ml的编码区内部都有终止密码子,导致了这些基因不能表达,为沉默基因。3.LMW-GS基因编码蛋白的序列比对利用Bioedit软件将所克隆的新基因与从GenBank中调取的基因进行多序列比对分析。我们将12个LMW-m型基因分开为3个部分,分别与GenBank中的9个LMW-m型基因进行比对。将1个LMW-i型基因与GenBank中的9个LMW-i型基因进行比对。将1个LMW-s型基因与GenBank中的10个LMW-s型基因进行比对。序列比对结果表明,每一类型的基因与其同类型的基因具有较大的序列相似性。除了基因AgLMW-il、AgLMW-m6编码的蛋白分别在Ⅳ区的第47位和Ⅲ区的第63位上多出一个半胱氨酸残基外,其余基因编码的蛋白均具有8个半胱氨酸残基。我们推测,这个额外半胱氨酸残基的出现,可能增加分子间二硫键数目,使面团粘弹性增加。因此,我们推测克隆的这2个新基因可能和小麦的优良品质相关。基因TdLMW-ml、TzLMW-m2和AlLMW-m2所推导出的氨基酸序列在重复区含有大量的氨基酸的插入或替换,一个长的N-端重复区对小麦面粉的品质也有积极作用。因此,我们推测克隆的这3个新基因可能和小麦的优良品质相关。4.LMW-GS的二级结构预测本研究采用PSIPRED2.0二级结构预测方法,预测结果显示,AlLMW-m2、TdLMW-ml和AgLMW-il的β-折叠含量较高,进一步说明了它们可能为候选的优质基因。5.LMW-GS基因的遗传进化关系进化树分析表明:Ⅰ型基因明显比另外两种基因分离出来得早,而LMW-s基因和LMW-m基因相对亲缘关系较近。分化时间计算表明:LMW-ⅰ型基因大约在15.22百万年前就与LMW-m和LMW-s位点分离开来,LMW-m和LMW-s型基因编码位点的分离则大约发生在9.149百万年前。

全文目录


中文摘要  5-8
Abstract  8-11
目录  11-13
插图和附表清单  13-16
文中缩写中英文对照  16-17
1.文献综述  17-37
  1.1 小麦贮藏蛋白的分类  18-20
  1.2 小麦贮藏蛋白的分离方法  20-23
    1.2.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳  20-22
    1.2.2 生物质谱技术  22
    1.2.3 反相高效液相色谱  22
    1.2.4 高效毛细管电泳  22-23
  1.3 LMW-GS的氨基酸组成和分类  23-25
    1.3.1 LMW-GS的氨基酸组成  23-24
    1.3.2 LMW-GS的分类  24-25
  1.4 LMW-GS的基因定位及遗传多态性  25-27
    1.4.1 LMW-GS的基因定位  25-26
    1.4.2 LMW-GS的遗传多态性分析  26-27
  1.5 LMW-GS的分子结构及其编码基因的分子克隆  27-30
    1.5.1 分子结构  27-28
    1.5.2 分子克隆  28-30
  1.6 LMW-GS的空间结构特征和在形成谷蛋白聚合体中的作用  30-31
  1.7 LMW-GS基因的遗传进化关系  31-32
  1.8 LMW-GS对小麦品质的影响  32-35
  1.9 立题依据和论文设计  35-37
    1.9.1 立题依据  35
    1.9.2 论文设计  35-37
2.材料与方法  37-47
  2.1 实验材料  37
  2.2 LMW-GS的分离  37-40
    2.2.1 仪器设备  37-38
    2.2.2 蛋白质提取  38
    2.2.3 SDS-PAGE  38-40
  2.3 LMW-GS编码基因的分子克隆  40-47
    2.3.1 仪器设备  40
    2.3.2 小麦种子基因组DNA提取  40-41
    2.3.3 PCR基因扩增  41-43
    2.3.4 T-Vecter基因克隆  43-46
    2.3.5 基因序列比较与分析  46-47
3.结果与分析  47-117
  3.1 普通小麦及其近缘种LMW-GS的鉴定、编码基因克隆与测序  47-55
    3.1.1 LMW-GS的SDS-PAGE鉴定  47-50
    3.1.2 LMW-GS基因的PCR克隆与测序  50-55
  3.2 LMW-GS新克隆基因及其编码蛋白的序列特征分析  55-92
    3.2.1 LMW-GS序列的上下游特征分析  55
    3.2.2 LMW-m型谷蛋白亚基基因及其编码蛋白的序列特征分析  55-77
    3.2.3 LMW-i型谷蛋白亚基基因及其编码蛋白的序列特征分析  77-81
    3.2.4 LMW-s型谷蛋白亚基基因及其编码蛋白的序列特征分析  81-83
    3.2.5 普通小麦及其近缘种LMW-GS沉默基因的序列特征分析  83-92
  3.3 LMW-GS新克隆基因及其编码蛋白的序列比较分析  92-106
    3.3.1 两个新基因与其他已登录基因的上游序列比对  92
    3.3.2 LMW-m型谷蛋白亚基的氨基酸序列比较分析  92-100
    3.3.3 LMW-i型谷蛋白亚基的氨基酸序列比较分析  100-103
    3.3.4 LMW-s型谷蛋白亚基的氨基酸序列比较分析  103-106
  3.4 LMW-GS新克隆基因编码蛋白的二级结构预测  106-114
  3.5 LMW-GS基因的系统进化分析  114-117
4.讨论  117-121
5.结论  121-123
参考文献  123-142
附录:氨基酸中英文名及简写对应表  142-143
致谢  143-144
个人简介  144

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 禾谷类作物 > 麦 > 小麦
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