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杂交骨髓瘤细胞培养过程的模型化研究

作　者: 周枫
导　师: 袁景淇
学　校: 上海交通大学
专　业: 控制理论与控制工程
关键词: 杂交骨髓瘤细胞间歇/流加培养建模宏观动力学模型细胞周期模型
分类号: Q813
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

动物细胞培养是将来自动物体的某些器官或组织的细胞,在模拟的体内生理条件下进行体外培养的过程,可以用于分离和鉴定病毒、进行遗传工程、代谢及其调节方面的研究,或根据其表达产物方面的特点(如转录后修饰和产物胞外分泌等),生产出与人类健康和生存密切相关的生物技术产品。动物细胞培养发展至今,已成为大量高价值生物制药产品,包括单抗、病毒疫苗和激素的主要来源。作为医药生物高科技产业的重要部分,动物细胞培养无论在基础研究和应用研究方面都日渐受到生物技术界的重视,并显示出巨大的工业前景。动物细胞培养过程中影响因子众多,细胞内部控制生长和代谢的机理复杂,细胞对培养条件的变化非常敏感,培养条件的轻微变化都会引起产量的降低或细胞的死亡。动物细胞培养的数学模型可以将和动物细胞生理行为相关的信息整合在一起,通过数学模型,用定量的方式描述细胞的培养过程,用于仿真、优化和控制,从而有助于提高产品产量和质量,为工业化和大型化细胞培养的过程控制和优化提供指导。本文的主要创新点在于,1:建立了杂交骨髓瘤细胞基于化学计量平衡的宏观动力学模型,本文以X63-Ag8.653杂交骨髓瘤细胞系(Myeloma cell line)为例,从单个细胞代谢和细胞周期运行的微观角度出发,对群体细胞生长和代谢进行模型化研究,首先在细胞代谢流分析的基础上,确定以葡萄糖和谷氨酰胺为培养的主要底物,建立化学计量平衡模型,然后引入了葡萄糖代谢的调节器模型来描述葡萄糖的消耗,最终建立描述底物消耗、细胞内代谢同细胞产物生成和细胞生长的关系的宏观动力学模型;2:建立了细胞比生长速率驱动的细胞周期模型,通过宏观动力学模型获得细胞的比生长速率,根据比生长速率和细胞周期运行中各阶段时间长度的关系,得到细胞各期分率,从而获得了细胞培养的细胞周期模型。本文的主要工作内容包括:(1)动物细胞代谢分析动物细胞需要的养分众多,代谢途径复杂,通过分析主要的代谢途径,包括糖酵解、PPP途径、谷氨酰胺代谢和TCA循环,结合所涉实验的具体数据,确定了主要的营养底物和培养产物。将葡萄糖和谷氨酰胺作为主要的碳源和氮源,为细胞生长提供碳骨架和能源,同时产生乳酸、氨和丙氨酸等副产物,并完成细胞的增殖。养分的代谢也影响着细胞周期的进程,实验中也发现随着养分的消耗,细胞逐渐开始在G0/G1期积累,S期细胞比例逐渐减小,G2/M期细胞比例维持不变。(2)杂交骨髓瘤细胞基于化学计量平衡的宏观动力学模型在对杂交骨髓瘤细胞代谢分析的基础上,利用化学计量平衡的方法建立了杂交骨髓瘤细胞培养的宏观动力学模型。其中化学计量平衡模型由快速糖酵解模式和低速糖酵解模式两个子模型组成,分别描述细胞培养中葡萄糖代谢的多稳态现象,阐明细胞培养过程中,随着糖酵解速率的下降,副产物之一的乳酸的生成逐步下降,最后停止分泌的过程。底物的消耗模型中,谷氨酰胺消耗用扩展的Monod表示,葡萄糖的消耗用调节器模型和Monod模型来描述。将化学计量平衡模型、底物代谢模型和生物反应器模型结合,获得宏观动力学模型,表示操作变量(补料)和状态变量(细胞密度,副产物浓度,底物浓度)之间的关系。最后,分析了分泌型细胞系蛋白生成和细胞生长的关系。(3)杂交骨髓瘤细胞的细胞周期模型通过分析杂交骨髓瘤细胞周期运行的机理,以及周期蛋白在细胞周期各时相转变中的作用,建立了细胞比生长速率和细胞周期各期时间长度的关系,同时考虑了细胞生长中随机性的影响,建立了杂交骨髓瘤细胞周期模型。最后,将细胞周期模型和宏观动力学模型结合,形成完整的杂交骨髓瘤细胞生长宏观动力学-细胞周期组合模型,得到比生长速率和细胞周期各期细胞分率的关系。(4)模型的实验验证利用间歇培养和流加培养的数据对基于化学计量平衡的宏观动力学模型和细胞周期模型进行了验证。结果表明,宏观动力学模型可以较好地描述细胞生长和产物生成的过程;细胞周期模型可以对细胞各期的细胞分率的变化趋势进行描述。进一步,通过对模型参数的灵敏性分析,将不灵敏参数设为定值,进一步简化了模型。并将模型和国内外的研究进行了对比,得到模型的特色和进一步改进的方向。考虑到细胞培养过程中的存在很多不确定因素,引入模型参数滚动辨识的方法,对一组补料引起细胞培养环境变化较大的试验进行了验证,进一步提高了模型的实用性。

全文目录

摘要  3-6
ABSTRACT  6-15
第一章绪论  15-32
  1.1 引言  15-16
  1.2 动物细胞的培养  16-20
    1.2.1 动物细胞培养的发展  16-17
    1.2.2 动物细胞培养的方法  17-19
    1.2.3 动物细胞的代谢  19-20
    1.2.4 动物细胞培养与细胞周期  20
  1.3 细胞培养的模型化  20-26
    1.3.1 模型化的目的  22
    1.3.2 建模方法  22-23
    1.3.3 细胞培养模型的发展  23-26
  1.4 本文的主要创新点  26
  1.5 本文的主要工作  26-28
  参考文献  28-32
第二章动物细胞代谢分析  32-54
  2.1 引言  32
  2.2 影响细胞代谢的因素  32-37
    2.2.1 葡萄糖  32-33
    2.2.2 氨基酸  33-34
    2.2.3 血清  34
    2.2.4 溶氧率  34-35
    2.2.5 温度  35
    2.2.6 pH 值  35-36
    2.2.7 渗透压  36
    2.2.8 细胞密度  36
    2.2.9 代谢副产物的影响  36-37
  2.3 主要的代谢路径分析  37-44
    2.3.1 糖酵解  37-38
    2.3.2 戊糖磷酸化路径(PPP)  38-40
    2.3.3 TCA 循环  40-41
    2.3.4 谷氨酰胺的代谢  41-42
    2.3.5 总的代谢分析  42-44
  2.4 实验数据分析  44-49
  2.5 本章小结  49
  参考文献  49-54
第三章杂交骨髓瘤细胞培养宏观动力学模型  54-75
  3.1 引言  54-55
  3.2 间歇和流加培养过程  55-56
  3.3 基于化学计量平衡的宏观动力学模型  56-69
    3.3.1 代谢路径分析  58-60
    3.3.2 化学计量分析  60-63
    3.3.3 化学计量平衡模型  63-65
    3.3.4 底物消耗的调节器模型和细胞死亡模型  65-67
    3.3.5 生物反应器模型  67-68
    3.3.6 宏观动力学模型  68-69
  3.4 动物细胞培养中蛋白的生成模型  69-71
  3.5 本章小结  71
  参考文献  71-75
第四章杂交骨髓瘤细胞周期模型  75-95
  4.1 引言  75-76
  4.2 动物细胞周期机理  76-78
    4.2.1 细胞周期  76-77
    4.2.2 细胞周期的调控  77-78
  4.3 哺乳动物细胞周期的基因调控  78-82
    4.3.1 哺乳动物细胞周期运行中的调控点  78-80
    4.3.2 周期蛋白  80
    4.3.3 哺乳动物细胞CDK 的多样性及细胞周期调控的复杂性  80-81
    4.3.4 周期蛋白依赖型激酶抑制蛋白(CKI)在哺乳动物细胞周期中的调控作用  81-82
  4.4 细胞周期的模型化  82-91
    4.4.1 细胞周期调控的特点  83-85
    4.4.2 细胞周期建模  85-91
  4.5 宏观动力学－细胞周期组合模型  91
  4.6 本章小结  91-92
  参考文献  92-95
第五章模型的实验验证和分析  95-125
  5.1 引言  95
  5.2 材料与方法  95-98
    5.2.1 培养基  95-97
    5.2.2 细胞系和培养条件  97
    5.2.3 实验分析方法  97
    5.2.4 实验  97-98
  5.3 宏观动力学模型的验证  98-105
    5.3.1 葡萄糖比消耗速率调节器模型的验证  98-99
    5.3.2 宏观动力学模型的验证  99-105
  5.4 细胞周期模型的验证  105-107
  5.5 模型参数的辨识和灵敏性分析  107-109
    5.5.1 宏观动力学模型的辨识和灵敏性分析  107-109
    5.5.2 细胞周期模型的参数辨识  109
  5.6 模型分析  109-121
    5.6.1 宏观动力学模型  110-116
    5.6.2 细胞周期模型  116-118
    5.6.3 宏观动力学模型的参数滚动辨识  118-121
  5.7 本章小结  121-123
  参考文献  123-125
第六章总结与展望  125-128
  6.1 总结  125-126
  6.2 展望  126-128
致谢  128-130
作者攻读博士学位期间发表的论文和奖励  130-132

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