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GPX和SOD协同作用模拟和新含硒肽的抗肿瘤作用

作　者: 邹险峰
导　师: 罗贵民
学　校: 吉林大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 模拟物 吉林大学 硒代半胱氨酸 双功能酶 抗氧化酶 活性氧 细胞存活率 含硒化合物 博士学位论文 细胞内
分类号: R730.5
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


活性氧（ROS）是具有高度反应性的O2的代谢产物,可以被生物体内的抗氧化系统（非酶抗氧化剂和抗氧化酶）及时清除,维持体内自由基的平衡。抗氧化酶主要包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）等。任何一种抗氧化酶都不能清除所有类型的活性氧,需要多种酶的协同作用才能完成。而且过量的SOD单独使用,可能会产生大量的H2O2毒害机体。因此,SOD与其他过氧化物清除酶如GPX结合使用是十分必要的。GPX是一种含硒酶,其中的硒成分除了构成GPX这种重要的抗氧化酶之外,还被认为是一种有效的抗癌剂。含硒化合物依布硒等已表现出抗肿瘤的生物活性,而且它还是典型的GPX模拟物,因此我们希望了解其它的GPX模拟物是否也具有抗肿瘤效果,以及GPX的抗氧化与抗肿瘤的关系,这在现实生活中具有极其重要的意义。目前抗肿瘤的硒化合物:亚硒酸盐、甲基硒代半胱氨酸和依布硒等或者毒性较大,或者溶解度差,我们希望应用人体的天然硒成分-硒代半胱氨酸（Sec）,但是Sec溶解度也很低,代谢时间短,不宜直接应用。因此,我们利用Arg-Gly-Asp （RGD）三肽与αvβ3整合素具有较高亲和力的特点构建并合成了Sec-RGD肽,最终得到的是其氧化形式Asp-Gly-Arg-Sec-Sec-Arg-Gly-Asp,即Se8P。活力和动力学分析显示Se8P同时也是GPX模拟物。细胞学研究表明,Se8P对H2O2诱导的非洲绿猴肾vero细胞损伤有明显的保护作用。肿瘤细胞学研究表明,Se8P能够诱导人黑素瘤A375细胞凋亡,凋亡由ROS的生成而启动,并且线粒体膜受到损伤。我们还发现谷胱甘肽（GSH）对Se8P诱导A375细胞凋亡起到抑制作用,说明GPX模拟物Se8P在诱导肿瘤细胞凋亡时需要克服自身的抗氧化功能。含硒肽Se8P的这种能够诱导肿瘤细胞凋亡的能力使其有望开发成为抗肿瘤新药。在生物体内,SOD、GPX和CAT相互协同清除各种活性氧,并且这种协同作用对机体的正常代谢至关重要。我们利用罗贵民实验组开发的SOD模拟物17CuP和GPX模拟物15SeP ,构建了并合成了双功能酶前体多肽32P,再经硒化和鳌合铜得到最终产物Se-Cu-32P。活力测定证实了Se-Cu-32P是一种新的双功能酶多肽模拟物。细胞学研究表明,在H2O2和XOD/Xanthine/ Fe2+两种活性氧产生体系中,Se-Cu-32P可抑制活性氧对非洲绿猴肾vero细胞的损伤,而天然SOD在XOD/Xanthine/ Fe2+损伤体系中可加剧活性氧对vero细胞的损伤。我们的结果证实了抗氧化酶的协同作用对维持细胞正常功能的重要性。Se-Cu-32P作为一种新的双功能酶模拟物有望被开发成为有前途的治疗活性氧自由基引起的相关疾病的新药。

全文目录


提要  4-15
第一章 本论文立论依据  15-23
第二章 含硒肽模拟谷胱甘肽过氧化物酶  23-47
  第一节 序言  23-24
  第二节 硒代半胱氨酸及其衍生物的合成  24-30
    一、实验材料  24-25
      1、药品和试剂  24-25
      2、实验仪器  25
    二、实验方法  25-28
      1、β－氯－丙氨酸的合成  25-26
      2、硒代胱氨酸(Selenocystine)的合成  26-27
      3、H-Sec(PMB)-OH 的合成  27
      4、Fmoc-Sec(PMB)-OH 的合成  27-28
      5、Fmoc-Sec(PMB)-OH 的质谱分析  28
    三、结果和讨论  28-30
      1、Fmoc-Sec(PMB)-OH 的合成  28-29
      2、Fmoc-Sec(PMB)-OH 的表征  29-30
  第三节 具有 GPX 活性的硒肽的合成及性质研究  30-42
    一、实验材料  30-32
      1、药品和试剂  30-31
      2、肽合成主要试剂的配制  31-32
      3、实验仪器  32
    二、实验方法  32-35
      1、含硒肽合成  32-33
      2、合成硒肽的表征  33-34
      3、GPX活力测定  34
      4、稳态动力学研究  34-35
      5、最适温度和最适pH  35
    三、结果与讨论  35-41
      1、硒肽的合成与纯化  35-36
      2、硒肽的质谱分析  36-37
      3、含硒多肽的硒含量检测  37
      4、Se8P 的GPX 活力  37
      5、Se8P的稳态动力学  37-39
      6、Se8P 的最适pH 和最适温度  39-41
    四、讨论  41-42
  本章小节  42-43
  参考文献  43-47
第三章 含硒肽诱导人黑素瘤 A375 细胞凋亡  47-73
  第一节 序言  47-48
  第二节 含硒多肽诱导黑素瘤细胞凋亡  48-57
    一、实验材料  48-49
      1、主要试剂  48
      2、主要仪器  48
      3、试剂配制  48-49
    二、实验方法  49-53
      1、细胞培养  49-50
      2、细胞形态学观察  50
      3、MTT 法测细胞存活率  50-51
      4、细胞胞浆酶—乳酸脱氢酶(LDH)含量测定  51-52
      5、二苯胺(DPA)法分析细胞内的DNA片段化  52
      6、统计学分析  52-53
    三、结果与讨论  53-56
      1、细胞形态学分析  53
      2、Se8P对人黑素瘤A375细胞的生长抑制  53-54
      3、Se8P对A375细胞的毒性作用  54-55
      4、A375细胞DNA片段化分析  55-56
    四、讨论  56-57
  第三节 含硒多肽诱导黑素瘤细胞凋亡的机制  57-69
    一、实验材料  57-58
      1、主要试剂  57
      2、主要仪器  57
      3、试剂配制  57-58
    二、实验方法  58-62
      1、细胞培养  58-59
      2、A375 细胞内活性氧的荧光检测  59
      3、A375细胞内活性氧的流式细胞仪检测  59
      4、A375 细胞内线粒体跨膜电位的荧光检测  59-60
      5、A375 细胞内线粒体跨膜电位流式细胞仪检测  60
      6、细胞胞浆谷胱甘肽过氧化物酶活力检测  60-61
      7、细胞内谷胱甘肽含量的检测  61
      8、GSH，DTT和SOD对Se8P诱导A375细胞凋亡的影响  61
      9、统计学分析  61-62
    三、结果和讨论  62-67
      1、Se8P 诱导细胞内活性氧(ROS)的产生  62
      2、Se8P 诱导的细胞内活性氧(ROS)的流式细胞仪检测  62-63
      3、Se8P诱导A375细胞内线粒体跨膜电位(△Ψm)变化的荧光检测  63-64
      4、Se8P 诱导的细胞内线粒体跨膜电位的流式细胞仪检测  64-65
      5、Se8P 引起A375 细胞内GPX 和GSH 的变化  65-66
      6、GSH，DTT 和SOD 对Se8P 诱导A375 细胞凋亡的影响  66-67
    四、讨论  67-69
  本章小节  69
  参考文献  69-73
第四章 具有SOD和GPX活力的双功能含硒多肽  73-92
  第一节 序言  73-74
  第二节 双功能酶的多肽前体的合成和表征  74-80
    一、实验材料  74-76
      1、药品和试剂  74-75
      2、肽合成主要试剂的配制  75-76
      3、实验仪器  76
    二、实验方法  76-78
      1、多肽合成  76-77
      2、合成多肽的表征  77-78
    三、结果与讨论  78-80
      1、双功能酶多肽前体的构建  78
      2、多肽的合成与纯化  78
      3、多肽的 HPLC 分析  78-79
      4、多肽的质谱分析  79-80
    四、结论  80
  第三节 双功能模拟物的制备和性质研究  80-88
    一、实验材料  80-81
      1、药品和试剂  80
      2、实验仪器  80-81
    二、实验方法  81-83
      1、NaHSe的制备  81
      2、含硒多肽的制备  81
      3、含硒多肽与铜螯合  81
      4、硒含量的测定  81-82
      5、铜含量的测定  82
      6、双功能多肽的 GPX 活力测定  82
      7、双功能多肽的 SOD 活力测定  82-83
      8、双功能多肽的GPX活力的稳态动力学研究  83
    三、结果和讨论  83-87
      1、双功能多肽的合成  83-84
      2、Se-Cu-32P的表征  84
      3、双功能多肽的GPX 活力和SOD 活力  84-85
      4、双功能多肽 GPX 活力的稳态动力学  85-87
    四、讨论  87-88
  本章小节  88-89
  参考文献  89-92
第五章 含硒多肽的抗氧化生物学效应研究  92-109
  第一节 序言  92-93
  第二节 GPX 模拟物的生物学效应  93-98
    一、实验材料  93-94
      1、主要试剂  93
      2、主要仪器  93
      3、试剂配制  93-94
    二、实验方法  94-95
      1、细胞培养  94
      2、H_2O_2对vero细胞的损伤  94
      3、MTT 法测细胞存活率  94-95
      4、LDH 含量测定  95
      5、统计学分析  95
    三、结果与讨论  95-98
      1、H_2O_2对vero细胞存活率的影响  95-96
      2、GPX模拟物对H_2O_2 损伤的vero细胞的保护作用  96-97
      3、GPX模拟物对H_2O_2泄漏vero细胞LDH的影响  97-98
  第三节 双功能多肽的生物学效应  98-104
    一、实验材料  98-99
      1、主要试剂  98-99
      2、主要仪器  99
      3、试剂配制  99
    二、实验方法  99-101
      1、细胞培养  99-100
      2、H_2O_2 对vero细胞的损伤  100
      3、XOD/Xanthine/Fe~(2+)对vero细胞的损伤  100
      4、MTT 法测细胞存活率  100-101
      5、统计学分析  101
    三、结果和讨论  101-103
      1、双功能酶对H_2O_2 损伤的培养vero 细胞的保护作用  101-102
      2、双功能酶对XOD/Xanthine/Fe~(2+)损伤的培养vero细胞的保护作用  102-103
    四、讨论  103-104
  本章小节  104-105
  参考文献  105-109
作者简历  109
博士期间已发表和待发表的文章  109-111
致谢  111-112
中文摘要  112-116
ABSTRACT  116-119

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 一般性问题 > 肿瘤治疗学
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